植物病毒病檢測及防治的研究進(jìn)展

婁 虎， 徐 熔， 王海竹， 徐啟江

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040)

據(jù)報(bào)道，每年僅在我國由于病毒感染農(nóng)作物造成的損失可達(dá)200億美元，植物病毒病引起的損失是世界人口生存的威脅之一[1-2]。植物病毒病檢測方法包括形態(tài)學(xué)方法(生物學(xué)檢測法、電子顯微鏡法)、免疫學(xué)方法[酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunesorbent assay，ELISA)、免疫熒光檢驗(yàn)法(immunofluorescence，IF)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、電印跡免疫分析(electro-bot immuno assay，EBIA)]、分子生物學(xué)方法[聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR)、多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(multiplex RT-PCR)、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR(reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR)、微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)、免疫沉淀反轉(zhuǎn)錄PCR(immunoprecipitation reverse transcription PCR，IP-RT-PCR)、原位RT-PCR]和納米生物傳感器技術(shù)。植物病毒病防治策略包括農(nóng)業(yè)措施、抗病育種(莖尖脫毒繁育無病毒苗木、植物病毒基因工程)、化學(xué)藥劑防治(植物病毒天然抑制劑、化學(xué)合成抑制劑)、弱毒疫苗接種技術(shù)。

研究者對各種方法在時(shí)效性、可操作性、準(zhǔn)確性、靈敏度等方面持有不同態(tài)度，Nam等利用多重RT-PCR技術(shù)檢測出SLV(shallot latent virus)、LYSV(leek yellow stripe virus)、GCLV(garlic common latent virus)、Allexivirus、OYDV(onion yellow dwarf virus)等5種大蒜病毒[3]；Hu等利用多重RT-PCR技術(shù)檢測出SLV、LYSV、OYDV、Allexivirus等4種大蒜病毒，且取1 μL以1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋10 000倍時(shí)仍能夠出現(xiàn)清晰的條帶[4]；袁青等利用二重RT-PCR檢測出馬鈴薯X病毒(potato virus X，PVX)和馬鈴薯A病毒(potato virus A，PVA)2種病毒，且在2種下游引物(PVX、PVA)體積比為0.4 ∶1.0時(shí)RT-PCR反應(yīng)的效果最好，無非特異性條帶[5]；董代幸等則利用一步法多重RT-PCR同時(shí)檢測出PVX、PVY(potato virus Y)、PLRV(Potato leaf roll virus)、PVA等4種馬鈴薯病毒，探索了Taq酶濃度對多重RT-PCR效果的影響，且Taq酶濃度最低為 5 U/μL 時(shí)可以出現(xiàn)清晰的條帶，總RNA的最低檢測濃度為7.8 μg/L時(shí)可擴(kuò)增出產(chǎn)物[6]。利用RT-PCR技術(shù)只能檢測出常見的病毒，此法對PCR引物的設(shè)計(jì)具有較高的依賴性，研究者對多重PCR反應(yīng)中的產(chǎn)物能否同時(shí)檢測出不同病毒仍然持有爭議，有待于探索新方法對此進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 植物病毒的檢測方法

1.1 形態(tài)學(xué)方法

形態(tài)學(xué)方法主要包括生物學(xué)檢測法和電子顯微鏡法。

生物學(xué)檢測法是借助于對某些病毒敏感的植物而進(jìn)行的病毒鑒定方法，指示植物是指對某一種或某幾種病毒及類病毒具有敏感反應(yīng)，一旦被感染能很快表現(xiàn)出明顯癥狀的植物。隨著研究者對植物病毒的深入研究，從病毒感染的植株宏觀表型上很難分辨出病毒的種類，因此電子顯微鏡逐漸應(yīng)用于植物病毒的檢測中。電子顯微鏡法是將染病組織制樣，可根據(jù)病毒的形態(tài)、大小、內(nèi)含體及染病組織超微結(jié)構(gòu)等用來診斷病毒的種類，分辨率可達(dá)0.1 nm，而病毒粒體大小為10～100 nm。Shapiro等利用電子顯微鏡對珊瑚的形成進(jìn)行微觀的觀察研究，對珊瑚的鈣化、形成等機(jī)制進(jìn)行了探討[7]；de Souza等利用電子顯微鏡對鳳梨科觀賞植物進(jìn)行組織觀察分析，為觀賞植物的組織培養(yǎng)及發(fā)育的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[8]；肖英等詳細(xì)介紹了電子顯微鏡對植物病毒檢測的步驟及研究方法，最常用的方法為負(fù)染色技術(shù)和超薄切片技術(shù)[9]；Henderson等利用超微電子顯微鏡對微藻的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了細(xì)致的觀察和分析[10]。對植物病毒的檢測，即使寄主植物的病毒含量極低，電子顯微鏡也可以進(jìn)行有效的檢測，利用電子顯微鏡與其他檢測方法相結(jié)合檢測效果更好。

1.2 免疫學(xué)方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一種固相吸附和免疫酶技術(shù)相結(jié)合的方法，將抗原和抗體包被在固相支持物上，使免疫反應(yīng)在固體表面進(jìn)行，并借助結(jié)合在抗體或抗原上的酶與底物反應(yīng)所產(chǎn)生的顏色變化來檢測病毒。Li等對酶聯(lián)免疫吸附原理改進(jìn)后檢測了大麥黃矮病毒屬(Barley yellow dwarf virus，BYDV)GPV、GAV、PAV、RMV等4個(gè)株系病毒，且將葉提取物檢測濃度稀釋至0.195 g/L后仍能夠明顯地檢測出結(jié)果[11]；Charoenvilaisiri等將RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)相結(jié)合(RT-PCR-ELISA技術(shù))，檢測出辣椒黃矮病毒(capsicum chlorosis virus，CaCV)、甜瓜斑點(diǎn)病毒(melon yellow spot virus，MYSV)、番茄致死環(huán)斑病毒(tomato necrotic ringspot virus，TNRV)和西瓜銀色斑點(diǎn)病毒(watermelon silver mottle virus，WSMoV)等4種病毒，且RT-PCR-ELISA技術(shù)檢測的靈敏度是普通RT-PCR技術(shù)的 10～1 000倍[12]；Zang等利用酶聯(lián)免疫吸附原理結(jié)合傳感器介紹了檢測煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)的新方法，微傳感器的最低檢測濃度達(dá)到了9.1 ng/mL[13]。

1.2.2 免疫熒光檢驗(yàn)法 免疫熒光檢驗(yàn)法是一種利用顯微技術(shù)與免疫中抗原抗體的特異性原理檢測病原體感染的植物組織，將植物組織樣品制成組織薄片于載玻片上，通過結(jié)合特定抗體的熒光染料來實(shí)現(xiàn)可視化目標(biāo)的分布，根據(jù)熒光顯示病毒的質(zhì)粒形態(tài)、大小、內(nèi)含體等診斷病毒種類，此法同樣可以結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)共同檢測病毒以便提高檢測靈敏度，Wullings等結(jié)合這2種方法檢測出馬鈴薯中的病毒[14]。免疫熒光檢測法、熒光原位雜交等熒光顯微技術(shù)面臨的重要問題是存在光漂白現(xiàn)象，即光漂白造成的熒光減弱或不可恢復(fù)性熒光消失，可以通過控制激發(fā)光照度、曝光的持續(xù)時(shí)間、增加熒光團(tuán)的濃度等方法進(jìn)一步增加檢測方法的靈敏度。

1.2.3 熒光原位雜交 熒光原位雜交技術(shù)是把顯微鏡技術(shù)、熒光技術(shù)、DNA分子雜交技術(shù)相結(jié)合的植物病毒檢測方法，植物中含有病原體的核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)用于識(shí)別病原體rRNA的分子探針在熒光原位雜交技術(shù)中能夠檢測出感染植物病毒的種類及含量。熒光原位雜交技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性，對病原體保守的rRNA序列具有特異性的識(shí)別與結(jié)合。Shargil等利用FISH技術(shù)檢測出黃瓜綠斑駁花葉病毒(cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)，在植物組織中可形成清晰、光亮的熒光，使植物病毒檢測的直觀性、特異性、準(zhǔn)確性更高[15]；Kliot等利用FISH技術(shù)在植物組織及昆蟲體內(nèi)成功定位出番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)的位置，為植物病毒病及昆蟲傳播的防治提供技術(shù)支持[16]?？煽啃院玫腇ISH技術(shù)高度依賴于核苷酸探針的特異性，探針特異性不強(qiáng)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等均是須要解決的問題。

1.2.4 電印跡免疫分析 電印跡免疫分析法首先要提取病毒蛋白，利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離病毒外殼蛋白，把蛋白帶轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上，再進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，根據(jù)外殼蛋白分子量和吸附特異性抗血清顯示特殊條帶來判斷病毒的存在。電印跡免疫分析與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，可用于檢測低濃度的植物病毒，靈敏度較高。但此方法不適用于大量樣品的檢測，且相對操作較為復(fù)雜[17]。

1.3 分子生物學(xué)方法

1.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR技術(shù)將引物、待擴(kuò)增DNA樣品、dNTP和DNA聚合酶加入到PCR緩沖液中，經(jīng)反復(fù)加熱變性和退火延伸，最后利用瓊脂糖凝膠電泳或核酸雜交技術(shù)進(jìn)行植物病毒檢測。Geri等利用PCR技術(shù)成功克隆出花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)，并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作[18]；Osman等利用定量PCR技術(shù)檢測出3種葡萄病毒，檢測不同地區(qū)的48個(gè)品種得出，95.83% 的品種為多種病毒的復(fù)合感染，單一病毒感染的現(xiàn)象極少出現(xiàn)[19]；Feng等運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測出黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus，CMV)，并建立了方程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[20]。PCR用于植物病毒的鑒定與分類，靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡便，特別是當(dāng)樣品病毒含量低，免疫學(xué)方法難以檢測出時(shí)，其檢測效果較好。PCR技術(shù)受到引物設(shè)計(jì)的限制，對于未知基因，隨機(jī)引物并不一定能夠快速、特異、完整地復(fù)制出病毒基因，PCR技術(shù)在這種情況下檢測植物病毒會(huì)有局限性。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用引物與模板結(jié)合的熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR一般使用TaqMan?熒光探針。TaqMan?熒光探針的5′端帶有熒光染料發(fā)出的熒光信號(hào)可被后端淬滅消失，熒光組分與淬滅組分分開產(chǎn)生熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與目標(biāo)序列濃度或拷貝數(shù)成正比。在每個(gè)循環(huán)中，均會(huì)有分子被切割下來，熒光強(qiáng)度呈指數(shù)增長，如果在PCR過程中，底物序列不能同探針互補(bǔ)，則探針是游離的，沒雜交的探針仍然保持完整，熒光信號(hào)也就不能被檢測到。Zhang等利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)對玉米萎黃病毒(maize chlorotic mottle virus，MCMV)進(jìn)行檢測，玉米萎黃病毒的RT-PCR產(chǎn)物在40 fg/μL時(shí)仍能夠出現(xiàn)清晰的條帶，具有極高的靈敏度和特異性[21]；Eun等利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測出2種蘭花屬病毒(CymMV、ORSV)，且得到的2種蘭花病毒在濃度為5 fg/μL時(shí)即可檢測出病毒外殼蛋白基因的存在[22]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且靈敏度高、特異性和可靠性強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高，并且可以在1個(gè)反應(yīng)管內(nèi)完成，減少了污染，具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。

1.3.3 RT-PCR、mRT-PCR、RT-qPCR 植物病毒中大多數(shù)是RNA病毒，RNA病毒則需先將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此方法稱為RT-PCR。Silva等利用RT-PCR技術(shù)對山藥花葉病毒(Yam mosaic virus，YMV)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，RNA最小濃度為14 pg/μL時(shí)會(huì)出現(xiàn)非常明顯的電泳條帶[23]；Miglino等利用RT-PCR技術(shù)對病毒及大分子進(jìn)行檢測，如煙草脆裂病毒(TRV)、百合X病毒(LVX)、水仙斑點(diǎn)病毒(NMV)等，檢測效果較好[24]；Trzmiel等利用實(shí)時(shí) RT-PCR技術(shù)對土傳小麥花葉病毒(Soil-borne wheat mosaic virus，SBWMV)進(jìn)行檢測與鑒定，克隆分析了SBWMV的基因序列及同源性[25]。

在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了用于植物病毒檢測的多種方法，包括mRT-PCR和RT-qPCR。mRT-PCR為多重RT-PCR反應(yīng)，即在同一RT-PCR反應(yīng)體系中用幾對不同的引物同時(shí)檢測多個(gè)目的片段，達(dá)到快速、簡便的目的。逆轉(zhuǎn)錄定量PCR反應(yīng)(RT-qPCR)主要用于定量檢測逆轉(zhuǎn)錄后cDNA的含量，RT-qPCR技術(shù)具備較高的靈敏度與特異性。Nam等已經(jīng)成功利用此方法檢測出了多種大蒜病毒[3-4]；袁青等利用mRT-PCR技術(shù)檢測多種馬鈴薯病毒也相繼獲得成功[5-6]；Ali等利用多重RT-PCR檢測蘭花花葉病毒(CymMV)、蘭花斑點(diǎn)病毒(OFV)、齒舌蘭環(huán)斑病毒(ORSV)，且成功建立一步法多重RT-PCR反應(yīng)體系應(yīng)用于蘭花病毒的檢測[26]；Osman等利用RT-qPCR技術(shù)對橘樹根枯病毒(citrus tristeza virus，CTV)、橘樹鱗皮病毒(citrus psorosis virus，CPsV)、橘樹葉斑病毒(Citrus leaf blotch virus，CLBV)進(jìn)行檢測，多重RT-PCR反應(yīng)能夠簡化病毒檢測步驟，提高檢測效率[27]；de Francesco等對RT-qPCR和ELISA 2種技術(shù)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，RT-qPCR 比酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)更靈敏，其相對的PCR檢測濃度分別為103～104、105～106CFU/mL[28]；Zhang等利用差速離心法對RT-PCR技術(shù)進(jìn)行改善，結(jié)果表明，改善后的方法增加了對馬鈴薯Y病毒檢測的靈敏度[29]。這種方法在一些病毒濃度較低的植物病毒檢測中起到了良好的作用，具備較高的靈敏度與特異性，這種方法對樣品的要求較低，既可以是鮮活的植物材料，也可以是種子，可以檢測出種質(zhì)資源內(nèi)部潛伏的一些病毒。

1.3.4 ddPCR、IP-RT-PCR、原位RT-PCR 微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)(ddPCR)是在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對樣品進(jìn)行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個(gè)納升(nL)級(jí)的微滴，每個(gè)微滴不含待檢核酸靶分子或含有1個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，逐個(gè)對每個(gè)微滴進(jìn)行核酸熒光檢測，有熒光信號(hào)為1，沒有熒光信號(hào)為0，根據(jù)泊松分布原理(poisson distribution)及陽性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。Koeppel等利用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)結(jié)合實(shí)時(shí)PCR技術(shù)共同對4種轉(zhuǎn)基因大豆MON87769、MON87708、MON87705、FG72和植物凝集素進(jìn)行分析和鑒定，利用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)檢測植物病毒具有更高的準(zhǔn)確性[30]；Lock等利用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)對腺病毒進(jìn)行研究，并與定量PCR進(jìn)行比較，其靈敏度、特異性和性價(jià)比均比定量PCR高[31]；Hindson等將微滴式數(shù)字PCR技術(shù)與實(shí)時(shí)PCR比較得出，微滴式數(shù)字PCR具有更高的精確性和靈敏度，核酸的定量檢測更為精確，是實(shí)時(shí)PCR的7倍，將為以后的癌癥檢測提供較好的手段[32]。

免疫沉淀反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(IP-RT-PCR)是免疫技術(shù)與PCR技術(shù)結(jié)合發(fā)展的一種植物病毒檢測技術(shù)。Lima等利用免疫沉淀反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測出木瓜致死黃病毒(papaya lethal yellowing virus，PLYV)、南瓜斑點(diǎn)病毒(squash mosaic virus，SQMV)、西葫蘆黃斑病毒(zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)等3種病毒[33]。植物提取物稀釋1 000倍時(shí)免疫沉淀反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)能夠檢測出PLYV病毒的存在，而酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)則為100倍；對于SQMV病毒，IP-RT-PCR的檢測限度為植物提取物稀釋100 000倍，ELISA的檢測限度為植物提取物稀釋10倍；對于ZYMV病毒IP-RT-PCR的檢測限度為植物提取物稀釋10 000倍，ELISA的檢測限度為植物提取物稀釋100倍[33]。原位RT-PCR技術(shù)能夠利用熒光探針定位植物病毒所在的植物組織部位，為植物病毒檢測提供了新思路，楊洪一等利用間接原位RT-PCR技術(shù)檢測出辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)主要位于柵欄組織，其次位于海綿組織，其他組織里很少或不存在[34]。

1.4 納米生物傳感器技術(shù)

用于檢測植物病毒的生物傳感器主要包括納米生物傳感器(nanomaterial sensor)、酶催化生物傳感器(enzymatic biosensor)、基于DNA的壓電生物傳感器(DNA-based piezoelectric biosensor)、DNA分子信標(biāo)生物傳感器(DNA-based molecular beacon biosensor)、石英晶體抗體生物傳感器(antibody-based quartz crystal biosensor)。生物傳感器是一種對生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測的儀器，是由固定化的生物敏感材料作識(shí)別元件(包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì))、適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器(如氧電極、光敏管、場效應(yīng)管、壓電晶體等)及信號(hào)放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)。

1.5 植物病毒檢測技術(shù)的比較

植物病毒由于其在植物組織中濃度較低、分布不均勻、潛伏期無病毒表型等特征，給研究者對病毒的檢測帶來挑戰(zhàn)，綜合比較各種植物病毒的檢測方法，由表1可知，形態(tài)學(xué)方法結(jié)合迅速發(fā)展的顯微鏡技術(shù)已經(jīng)能夠檢測到微量的反應(yīng)，分子生物學(xué)技術(shù)及生物微量傳感器比免疫反應(yīng)更靈敏，在利用和比較檢測手段的同時(shí)也須要綜合考慮時(shí)效性和性價(jià)比。

表1 當(dāng)前植物病毒檢測方法的比較

2 植物病毒的防治策略

2.1 農(nóng)業(yè)措施

在明確病毒病害的發(fā)生規(guī)律、傳毒介質(zhì)及與氣候、耕作制度等關(guān)系的基礎(chǔ)上，消除病毒病的傳染源，對農(nóng)作物進(jìn)行合理的輪作、間作、倒茬等，適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行施肥、灌溉、合理密植均可以改善植物的生長狀態(tài)，提高它對病毒的抵抗力。Blanc等利用農(nóng)業(yè)技術(shù)防治蚜蟲傳播植物病毒，對植物組織及蚜蟲傳播途徑進(jìn)行了細(xì)致的分析研究[46]；Bosque-Pérez等利用蚜蟲傳播植物病毒途徑，分析研究了小麥黃矮病毒和馬鈴薯卷葉病毒的危害情況，管理好田間植物和土壤、切斷病毒傳播途徑、培育壯苗及拔除早期病株等可在一定程度上減輕病毒病的危害程度[47]。

2.2 抗病育種

2.2.1 莖尖脫毒繁育無病毒苗木 病毒侵染植物后可進(jìn)入植物細(xì)胞，在迅速分裂的細(xì)胞中，其分裂速度比病毒DNA復(fù)制速度快，因此，采用旺盛分裂的莖尖分生組織進(jìn)行離體培養(yǎng)就可以獲得脫毒植物。高山林等應(yīng)用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)成功培養(yǎng)出大蒜幼苗，最適愈傷組織誘導(dǎo)激素配比為MS+0.2 mg/L 芐氨基嘌呤(BA)+0.5 mg/L 萘乙酸(NAA)，最適芽誘導(dǎo)激素配比為MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA[48]；Resende等利用體外微體快繁技術(shù)，成功培育出鳳梨科植物的幼苗[49]；TakIn等利用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)成功脫除大蒜OYDV和LYSV 2種病毒，培育出無病毒植株幼苗，最適植物激素配比為MS+2 mg/L BA+0.5 mg/L IBA[50]；劉文萍等應(yīng)用莖尖脫毒組織培養(yǎng)技術(shù)成功脫毒大蒜病毒，選取附帶1個(gè)葉原基的莖尖分生組織，最適激素配比為MS+0.5 mg/L 激動(dòng)素(KT)+0.5 mg/L NAA[51]。

利用莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)已培育出無毒蘋果、馬鈴薯、甘薯、大蒜、草毒和菊花等一大批無毒苗木。這些無毒苗在生產(chǎn)上的應(yīng)用已經(jīng)取得了明顯的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，但缺點(diǎn)是成本高、工作量大，且由于病毒的田間再次侵染，維持無毒的有效期不長，2～3年后產(chǎn)量又會(huì)嚴(yán)重下降。

2.2.2 植物病毒基因工程 研究者已運(yùn)用各種基因工程策略在多種植物上得到不同程度的抗病毒能力。國內(nèi)有轉(zhuǎn)基因抗病毒煙草、番茄、甜椒等產(chǎn)品已獲準(zhǔn)商業(yè)化應(yīng)用，培育、推廣應(yīng)用抗病毒品種是最經(jīng)濟(jì)、最有效的防治措施之一。Yoon等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使大麥黃矮病毒(barley yellow dwarf virus，BYDV)、谷物黃矮病毒(cereal yellow dwarf virus，CYDV)在植物中不表現(xiàn)出病毒癥狀，可提高作物的產(chǎn)量，轉(zhuǎn)染其他作物則表現(xiàn)出病毒癥狀[52]；Chung等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功構(gòu)建出3種馬鈴薯病毒(PVA、PVY、PLRV)的無癥狀植株，植株長勢良好，檢測含3種病毒，但無病毒表型出現(xiàn)，提高了作物的產(chǎn)量[53]；侯文勝等構(gòu)建了大豆的轉(zhuǎn)基因植物，提高了作物的產(chǎn)量[54]；謝龍旭等成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因煙草，不表現(xiàn)出煙草花葉病毒侵染的癥狀[55]；孫越等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了兼抗蟲、抗除草劑、抗干旱的轉(zhuǎn)基因玉米，大幅度提高了玉米的產(chǎn)量[56]。

研究者對轉(zhuǎn)基因植物及其分泌物對環(huán)境的影響一直持有爭議，賴欣等應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因大豆，并研究了分泌物對大豆根部細(xì)菌群落的影響，結(jié)果顯示，其分泌物對固氮細(xì)菌沒有影響[57]；王麗娟等對轉(zhuǎn)基因大豆和正常大豆進(jìn)行比較分析，轉(zhuǎn)基因大豆根系微生物利用單一碳源比非轉(zhuǎn)基因大豆多，整體利用率無差異[58]；Chatthai等應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子生物學(xué)分析出轉(zhuǎn)基因作物松科植物在基因上游表現(xiàn)出較強(qiáng)的保守性，成功完成轉(zhuǎn)基因植株的培育[59]；Silva等對4種轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行分析，其抗蟲、抗病毒作用明顯，但轉(zhuǎn)基因只在1代起作用，傳代的作物不表現(xiàn)出轉(zhuǎn)基因的抗蟲抗病性[60]；Li等利用2個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其與非轉(zhuǎn)基因棉花比較根系會(huì)分泌更多的糖和氨基酸，根系分泌物可以促進(jìn)真菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長，表明轉(zhuǎn)基因植物不安全[61]；Wu等對轉(zhuǎn)Bt蛋白基因的棉花進(jìn)行研究，結(jié)果表明它與正常的棉花無差異，表明轉(zhuǎn)基因植株是安全的，轉(zhuǎn)基因植物的安全性還須進(jìn)一步分析研究[62]。

2.3 化學(xué)藥劑防治

由于病毒寄生于寄主細(xì)胞內(nèi)，與寄主細(xì)胞共存，難以找到對病毒有殺傷作用又對寄主無損害的選擇性化學(xué)藥物。為了開發(fā)出比較理想的抗植物病毒藥物，研究人員從天然抗病毒植物藥劑和化學(xué)合成抗病毒藥劑2個(gè)方面開展了研究。目前正在使用的化學(xué)藥劑主要有蛋白質(zhì)類、生物堿類、黃酮類、有機(jī)酸、堿基衍生物、多聚糖以及植物激素等。Prabahar等發(fā)現(xiàn)，多種化學(xué)物質(zhì)可以抑制煙草花葉病毒，異丙腎上腺素、核黃素、阿托品、阿苯達(dá)唑、新霉素、氨芐青霉素等均能夠抑制茄科植物感染的煙草花葉病毒(TMV)[63]；李紅霞研究了香菇多糖、中草藥提取物、五倍子提取物對煙草花葉病毒的抑制作用[64]；陳啟建研究了黃酮苷、大蒜精油等對煙草花葉病毒的抑制作用[65]；采用合理的復(fù)配制劑、適時(shí)用藥是充分發(fā)揮化學(xué)防治作用的重要因素。

2.4 弱毒疫苗接種技術(shù)

弱毒疫苗接種技術(shù)是利用植物經(jīng)常感染或易于感染的病毒對已經(jīng)接種處理過的植株再次感染這一植物病毒時(shí)，植株會(huì)對其產(chǎn)生免疫，同時(shí)弱毒不會(huì)對植株產(chǎn)生強(qiáng)烈的影響，采用弱毒疫苗接種技術(shù)防治蔬菜、果樹病毒病已經(jīng)獲得了較大的研究進(jìn)展。覃秉益等利用弱毒疫苗技術(shù)對煙草花葉病毒番茄株弱毒疫苗N14的安全性進(jìn)行測定，將其接種到17種不同科的植物，每種4株，其中除矮牽牛表現(xiàn)輕微的花葉癥狀外，其他植物均無癥狀，弱毒疫苗已連續(xù)傳代100多次，毒力無明顯變化[66]；易榮大介紹了弱毒疫苗接種技術(shù)的過程及注意事項(xiàng)，利用弱毒疫苗接種的番茄花葉病毒使番茄產(chǎn)量大幅上升，具有減少農(nóng)藥用量、不污染環(huán)境、不影響生態(tài)平衡等優(yōu)點(diǎn)[67]。

2.5 植物病毒防治策略的比較分析

隨著對植物病毒傳播途徑的深入了解，加快抗病毒藥物的研制是目前最直接有效的防治手段，各種轉(zhuǎn)基因抗病植物相繼建成，并應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。但是真正經(jīng)濟(jì)、實(shí)惠、便于農(nóng)民接受的防治病毒病的措施仍是推廣抗病或耐病的優(yōu)良品種，因此，選育抗病毒病或耐病毒病的作物品種意義重大。表2比較分析了現(xiàn)階段防治植物病毒病的策略。

表2 植物病毒病防治策略的比較分析

3 展望

PCR技術(shù)憑借著其操作簡單、結(jié)果可信、實(shí)用性廣等優(yōu)點(diǎn)仍是應(yīng)用最廣泛的檢測手法之一，基于PCR技術(shù)的RT-PCR、mRT-PCR、ddPCR、IP-RT-PCR技術(shù)也日趨成熟。PCR技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)結(jié)合共同應(yīng)用于植物病毒檢測可以提高檢測的靈敏度和特異性，結(jié)合多種病毒檢測技術(shù)開發(fā)新產(chǎn)品具有較好的前景。Charoenvilaisiri等利用RT-PCR技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)結(jié)合開發(fā)出新的RT-PCR-ELISA技術(shù)用于檢測辣椒黃矮病毒(CaCV)、甜瓜斑點(diǎn)病毒(MYSV)、番茄致死環(huán)斑病毒(TNRV)和西瓜銀色斑點(diǎn)病毒(WSMoV)等4種病毒，檢測效果好、特異性強(qiáng)[12]。將納米技術(shù)、免疫技術(shù)、熒光技術(shù)、分子雜交技術(shù)等共同應(yīng)用于生物傳感器將是發(fā)展檢測技術(shù)的趨勢，使檢測技術(shù)更趨向于實(shí)時(shí)性和實(shí)效性。原位RT-PCR技術(shù)結(jié)合電子顯微鏡，能夠高分辨率地觀察到探針顯示的植物病毒在組織中的位置，為病毒病的檢測分析和防治提供了較好的理論基礎(chǔ)。

對植物病毒病的防治，應(yīng)本著易于推廣、靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高的目的開展機(jī)械化選苗育種，統(tǒng)一栽培管理，從源頭去除植物病毒，切斷植物病毒病的傳播途徑等。現(xiàn)階段對植物病毒侵染植物體的研究日益深入，病毒感染植物的機(jī)制不斷被人們發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)開發(fā)出一些能夠抑制或完全脫除多種植物病毒的化學(xué)藥物，后續(xù)研究者須要更加深入了解病毒在植物體中侵染繁殖的機(jī)制，開發(fā)出相應(yīng)的藥物用于預(yù)防、治療植物病毒病，減輕病毒病對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失。

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