二穗短柄草谷氨酸類受體系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和基因表達(dá)分析

劉 洋，安丹丹，程宇來(lái)，祁 智，亢 燕

(1.內(nèi)蒙古和盛生態(tài)科技研究院有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)是一種廣泛分布于溫帶地區(qū)的一年生單子葉植物，是禾本科(Poaceae)、早熟禾亞科(Pooideae)、短柄草族(Brachypodieae)、短柄草屬(Brachypodium)的植物，與大多數(shù)重要的禾本科農(nóng)作物即以小麥、大麥、燕麥和黑麥為主的麥類作物和以高丹草、蘇丹草、黑麥草和狗牙根等為主的飼用作物近緣。由于二穗短柄草植株矮小，一般在20 cm以內(nèi)；生活周期短；生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境要求低，易于培養(yǎng)，自花授粉，基因組小，只有300 Mb等特點(diǎn)，2001年就被提議作為單子葉模式植物[1-2]。隨后人們開始關(guān)注二穗短柄草并展開研究工作。2008年建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效短柄草遺傳轉(zhuǎn)化體系和T-DNA插入突變體庫(kù)[3]。2010年完成反復(fù)8次的二穗短柄草全基因組測(cè)序工作，研究發(fā)現(xiàn)二穗短柄草重復(fù)序列的大小和比例與擬南芥和水稻的相似，與麥類作物具有類似的基因組成和良好的共線性[2，4]。全基因組測(cè)序后，研究者們對(duì)短柄草進(jìn)行了更深入的研究，如根的形態(tài)建成[5]、開花時(shí)間調(diào)控的分子機(jī)理[6]以及生物脅迫(病毒、真菌)和非生物脅迫(冷、熱、鹽和干旱等)響應(yīng)機(jī)制等[7-12]。通過(guò)序列同源性來(lái)尋找并研究未報(bào)道的植物功能蛋白是研究未知植物蛋白的有效方法之一。Yordem等[13]用玉米Yellow Stripe-Like (ZmYSL) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列在短柄草數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast搜索，發(fā)現(xiàn)了19個(gè)二穗短柄草YSL成員，發(fā)現(xiàn)這19個(gè)BdYSLs成員在系統(tǒng)發(fā)生樹上分為4枝，其中1枝的成員具有禾草特異性，通過(guò)酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)證明了BdYSL具有Fe3+轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

谷氨酸除了具有營(yíng)養(yǎng)功能外，在動(dòng)物的中央神經(jīng)系統(tǒng)中還具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。它作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，由突觸前膜釋放，與突觸后膜的谷氨酸受體結(jié)合后，誘導(dǎo)氨基酸門控通道的打開或激活G蛋白偶聯(lián)受體[14]。谷氨酸受體包括離子型谷氨酸受體(ionotropic GluRs，iGLURs)，與神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)，可以形成K+、Na+和Ca2+陽(yáng)離子內(nèi)流通道，根據(jù)激動(dòng)劑的特異性，分為3種：N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-d-aspartate，NMDA)、紅藻氨酸受體(Kainate，KAR)和α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate，AMPA)受體；代謝型谷氨酸受體(metabotropic，mGLURs)，與G蛋白偶聯(lián)促進(jìn)激活第二信或iGLURs[15]。自從1989年人們發(fā)現(xiàn)與動(dòng)物iGLURs同源的植物谷氨酸受體(Glutamate Receptor-Like genes，GLRs)[16]后，發(fā)現(xiàn)植物谷氨酸受體具有重要的功能，參與C/N平衡、光合作用、非生物脅迫、根的形態(tài)建成、種子萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)、植物和病原菌的互作、細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)力學(xué)調(diào)控、接收和轉(zhuǎn)導(dǎo)氨基酸信號(hào)等[14，17-19]。在氨基酸水平上，植物GLRs有6個(gè)功能域，4個(gè)跨膜域M1-M4；2個(gè)配體結(jié)合域GlnH1和GlnH2，植物與iGLuRs中的NMDA受體的同源性較高，尤其是M3結(jié)構(gòu)域，序列相似性高達(dá)63%[14]。Aouini 等[20-21]在2011年用擬南芥AtGLRs氨基酸序列在番茄數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast搜索，發(fā)現(xiàn)15個(gè)SlGLRs，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)其分為3枝，其中一枝是番茄特異枝，比其他枝先發(fā)生分化。在擬南芥中異源過(guò)表達(dá)SlGLR1.1和SlGLR3.5后，發(fā)現(xiàn)它們可能參與Ca2+吸收。Ni等[22]發(fā)現(xiàn)水稻OsGLRs有13個(gè)成員，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生分析分為3枝即有3個(gè)亞家族，通過(guò)在HEK細(xì)胞中異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)OsGLR2.1介導(dǎo)Glu引起水稻根細(xì)胞的Ca2+升高。綜上所述，植物谷氨酸受體具有重要的生理功能，然而短柄草谷氨酸受體BdGLRs的相關(guān)研究尚未見報(bào)道，因此，筆者對(duì)短柄草的谷氨酸受體BdGLRs進(jìn)行初步研究，以期為后續(xù)BdGLRs家族各個(gè)成員的生物學(xué)功能進(jìn)行深入研究奠定基礎(chǔ)，也為后續(xù)禾本科農(nóng)作物和牧草遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

二穗短柄草由內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院祁智實(shí)驗(yàn)室保存。將二穗短柄草種子置于含5% NaClO和0.1% Tween20的消毒液中處理30 min，用無(wú)菌水清洗3次后，將表面消毒的種子置于MQA固體培養(yǎng)基上，4 ℃避光處理5 d后豎直置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)至三葉期。培養(yǎng)室溫度為23～25 ℃，濕度為60%～80%，光照周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度為100～120 μmol/(m2·s)。MQA培養(yǎng)基成分為：1%蔗糖；1%瓊脂糖；大量元素為5 mmol/L KNO3，1 mmol/L H3PO4，1 mmol/L MgSO4，1 mmol/L CaCl2；微量元素為0.03 mmol/L ZnSO4，0.1 mmol/L MnSO4，0.1 mmol/L H3BO3，5 μmol/L KI，0.2 μmol/L CuSO4，0.1 μmol/L CoCl2，0.1 μmol/L Na2MoO4；Fe鹽為0.1 mmol/L FeSO4，0.1 mmol/L Na2EDTA；5 mmol/L MES；BTP(Bis Tris Propane)調(diào)節(jié)pH值至5.7，高溫高壓滅菌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 候選二穗短柄草谷氨酸受體BdGLRs序列的獲得及系統(tǒng)發(fā)生分析 以擬南芥AtGLRs的氨基酸序列為種子序列，利用Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org/)中的Blast工具，搜尋可能存在的BdGLRs基因。擬南芥的20個(gè)GLRs氨基酸基因序列(表1)來(lái)自于The Arabidopsis Information Resource (TAIR)數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//phytozome.jqi.doe.gov/pz/portal/htm)。BdGLRs的氨基酸序列和CDS的長(zhǎng)度來(lái)自于PlantGDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.plantgdb.org)。

表1 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹所用的擬南芥、鼠和微生物的谷氨酸受體氨基酸序列登錄號(hào)Tab.1 Accession numbers and abbreviations for glutamate receptors in rat and Arabiopsis

基于二穗短柄草、擬南芥和鼠的GLRs氨基酸序列(表1)，利用BioEdit軟件的ClustalW模塊進(jìn)行多重比較和MEGA 6.06[23]軟件的Neighbor-joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(Neighbor-joining tree)。選取參數(shù)為自展值重復(fù)數(shù)(Bootstrap replicates)：1 000；模式/方法(Model/method)：Poisson；空白數(shù)據(jù)處理(Gaps data treatment)：Complete deletion。

1.2.2 半定量RT-PCR檢測(cè) 采用TRIzol法[24]分別提取二穗短柄草幼苗根、莖、葉的總RNA，用DNA酶(TaKaRa)消化可能殘留的DNA。通過(guò)超微量核酸蛋白測(cè)定儀Q5000(Quawell)測(cè)定RNA濃度，并將1 μg的總RNA通過(guò)First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用跨越內(nèi)含子的引物EF1 184和EF1 185(表2)進(jìn)行PCR，以檢驗(yàn)cDNA中是否有DNA污染。

將合成的cDNA用超微量核酸蛋白測(cè)定儀Q5000將濃度調(diào)節(jié)為400 ng/μL；稀釋10倍后取1 μL作為模板，半定量PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，50～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20～28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸3 min。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。將看家基因EF1α作為內(nèi)參基因，通過(guò)調(diào)節(jié)模板量將根、莖、葉的看家基因片段的電泳條帶調(diào)至亮度一致。獨(dú)立重復(fù)3次試驗(yàn)，確定合適的模板量。用BdGLRs特異性基因引物(表2)，選擇上述合適的模板量進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)是否有電泳條帶和電泳條帶的亮暗來(lái)推測(cè)BdGLRs在根莖葉的表達(dá)情況。

表2 BdGLRs的半定量和定量RT-PCR分析所用引物Tab.2 Primer sequences used in semi-quantitative and quantitative RT-PCR analysis

1.2.3 定量RT-PCR檢測(cè) 定量PCR分析的參比基因?yàn)锳CTIN，引物Actin2-8_F：5′-ACGGTAACATTGT GCTCAGTGGTG-3′；Actin2-8_R：5′-CTTGGAGATCCAC ATCTGCTGGA-3′。采用TransStart Tip Green qPCR SuperMix(北京全式金公司)在德國(guó)耶拿FlexCycler多通道熒光定量PCR儀Qtower 2.2中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)3次，引物(表2)和模板同半定量PCR分析，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃15 s，25個(gè)循環(huán)，最后采用2-ΔΔCt法，對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 二穗短柄草候選谷氨酸受體BdGLRs

用AtGLRs氨基酸序列Blast搜索二穗短柄草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)19個(gè)二穗短柄草候選BdGLRs，同擬南芥AtGLR2.2、AtGLR2.5、AtGLR2.7、AtGLR2.8、AtGLR3.3和AtGLR3.4有較高同源性，分布在二穗短柄草1～5號(hào)染色體上(表3)；氨基酸序列長(zhǎng)度523～1 008 Aa，cDNA長(zhǎng)度為1 572～3 027 bp(表3)。

表3 候選二穗短柄草谷氨酸受體GLRs家族Tab.3 The candidate GLR family members identified in Brachypodium distachyon

2.2 二穗短柄草候選谷氨酸受體BdGLRs的系統(tǒng)發(fā)生分析

基于二穗短柄草、擬南芥和鼠谷氨酸受體氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹表明，19個(gè) BdGLRs和20個(gè)AtGLRs聚為一大枝，先于鼠的iGLuRs分化，形成獨(dú)立大枝(Clade)，表明二穗短柄草和擬南芥親緣關(guān)系較近。將BdGLRs和AtGLRs共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)，BdGLRs沒有特異分枝，同AtGLRs的3個(gè)亞家族聚類在一起形成獨(dú)立3枝[25]。只有AtGLRs Clade Ⅲ和BdGLR Ⅲ形成分枝的自展值高達(dá)99，其他2枝的自展值低于70，分別為4和10(圖1)，不適合作為BdGLRs亞家族分類的依據(jù)。

圖1 二穗短柄草、擬南芥及鼠的谷氨酸受體氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.1 Phylogenetic analysis based on glutamate like receptor in Brachypodium distachyon，Arabiopsis thaliana and Rattus norvegicus

由于AtGLRs和BdGLRs親緣關(guān)系較近，相互干擾無(wú)法形成獨(dú)立分枝，因此，將20個(gè)AtGLRs和19個(gè)BdGLRs分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，AtGLRs分為3個(gè)亞家族，分別為AtGLR1.1-1.4、AtGLR2.1-2.9、AtGLR3.1-3.4，自展值都為100?；贐dGLRs構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與AtGLRs的類似，也分為3枝，Clade Ⅲ和Clade Ⅰ的自展值是100，不同的是BdGLRs Clade Ⅱ的自展值是57(圖2)，表明BdGLRs Clade Ⅱ成員與AtGLRs變異度更大。最后根據(jù)BdGLRs與AtGLRs不同成員在系統(tǒng)發(fā)育樹的位置以及AtGLRs的命名規(guī)則，將 BdGLRs分為3個(gè)亞家族，分別為BdGLR1.1-1.4，位于1號(hào)染色體；BdGLR2.1-2.10，位于1，2～4號(hào)染色體；BdGLR3.1-3.5，位于1，3和5號(hào)染色體(圖2、表3)。

圖2 擬南芥(A)和二穗短柄草GLRs(B)的系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on glutamate like receptor in Arabiopsis thaliana (A) and Brachypodium distachyon (B)

2.3 二穗短柄草谷氨酸受體基因表達(dá)半定量RT-PCR分析

通過(guò)半定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析，發(fā)現(xiàn)在二穗短柄草的三葉期，除BdGLR1.4、BdGLR2.6-2.10，其余BdGLRs在根、莖、葉中均有表達(dá)。BdGLR1.4在根和莖中表達(dá)，在葉中表達(dá)量較低或不表達(dá)；BdGLR2.7在莖和葉中表達(dá)，在根中表達(dá)量較低或不表達(dá)。BdGLR2.8在根表達(dá)，在莖和葉中表達(dá)量較低或不表達(dá)；BdGLR2.6、2.9、2.10條帶很弱，幾乎不可見，表明其在根、莖、葉中表達(dá)量較低或不表達(dá)。雖然絕大多數(shù)BdGLRs在根、莖、葉中均有表達(dá)，但BdGLR在不同組織中表達(dá)量不同，BdGLR1.1、BdGLR1.3、BdGLR2.2和BdGLR3.1在莖中的表達(dá)量明顯高于根和葉；BdGLR2.1、BdGLR2.5、BdGLR3.3和BdGLR3.4在莖和葉中的表達(dá)量明顯高于根中。在19個(gè)BdGLR中只有BdGLR3.5的在根、莖、葉中表達(dá)量幾乎一致(圖3)。

R.根；S.莖；L.葉。R.Roots；S.Stems；L.Leaves.

2.4 二穗短柄草谷氨酸受體基因表達(dá)定量RT-PCR分析

通過(guò)定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析，BdGLRs的不同成員在植物的根、莖和葉中表達(dá)差異較大。在根中，相對(duì)于BdGLR1.1，BdGLR2.4、BdGLR2.6-2.10、BdGLR3.2-3.4的表達(dá)量較低，而BdGLR3.5的表達(dá)量較高。在莖中，BdGLR1.2、BdGLR1.4、BdGLR2.3、BdGLR2.4、BdGLR2.6-2.10、BdGLR3.2-3.4的表達(dá)量較低，BdGLR3.1的表達(dá)量較高。在葉中，BdGLR2.3、BdGLR2.4、BdGLR2.6-2.10、BdGLR3.2-3.4的表達(dá)量較低，BdGLR2.5的表達(dá)量較高。在根、莖、葉中，絕大多數(shù)BdGLRCladeⅡ的成員表達(dá)量較低(圖4)。

*.P<0.01。

3 討論

本研究是通過(guò)與擬南芥谷氨酸受體(AtGLRs)氨基酸序列的同源性來(lái)尋找模式植物短柄草谷氨酸受體(BdGLRs)。Lam等[16]于1998年首次在擬南芥中發(fā)現(xiàn)AtGLRs，通過(guò)序列的同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與動(dòng)物離子型谷氨酸受體(iGLu)和大腸桿菌(Escherichiacoli)中谷氨酰胺滲透酶(Glutamine permease，GlnH)同源。Chiu等[25]將AtGLR1.1 cDNA sequence (AF079998)序列進(jìn)行Blast，發(fā)現(xiàn)AtGLRs有20個(gè)成員，基于系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析發(fā)現(xiàn)AtGLRs分為3個(gè)家族20個(gè)成員，分別為AtGLR1.1-1.4、AtGLR2.1-2.9、AtGLR3.1-3.7。后續(xù)人們對(duì)AtGLRs成員深入研究，發(fā)現(xiàn)它們?cè)跀M南芥中起著重要作用，如AtGLR1.1參與碳氮代謝平衡[26]；AtGLR3.3介導(dǎo)谷胱甘肽引起細(xì)胞質(zhì)的[Ca2+]升高，參與先天免疫；AtGLR3.6參與根發(fā)育[18]等。Aouini 等[20]在2011年用AtGLRs氨基酸序列在番茄數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast搜索，發(fā)現(xiàn)15個(gè)SlGLRs。Ni等[22]于2016年用AtGLRs氨基酸序列在水稻數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast搜索，發(fā)現(xiàn)13個(gè)OsGLRs，基于系統(tǒng)發(fā)生分析分為3枝，分別為OsGLR1.1-1.4、OsGLR2.1-2.4、OsGLR3.1-3.5。由此可見，通過(guò)AtGLRs的序列同源性及系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析來(lái)鑒定其他植物中GLRs的成員以及成員分類是可行的。據(jù)此本研究發(fā)現(xiàn)BdGLRs有20個(gè)成員，分為3個(gè)亞家族。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)生分析，BdGLRs和AtGLRs親緣關(guān)系較近，在系統(tǒng)發(fā)生樹中BdGLRs的成員分別于AtGLRs的3個(gè)不同亞家族分別聚類，只除BdGLR CladeⅢ與AtGLR CladeⅢ的自展值較高，為99外，其余2個(gè)家族分枝的自展值分布為4和10。由此推斷如果根據(jù)圖1對(duì)BdGLRⅠ和BdGLRⅡ進(jìn)行分類可能很不準(zhǔn)確，后續(xù)將BdGLRs和AtGLRs進(jìn)行單獨(dú)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，AtGLRs的3個(gè)亞家族與前人報(bào)道一致，3個(gè)亞家族分枝自展值都為100，結(jié)果可信。據(jù)此根據(jù)BdGLRs單獨(dú)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果對(duì)BdGLRs進(jìn)行分類較為可信。

本研究對(duì)BdGLRs基因表達(dá)的組織特異性進(jìn)行初步研究發(fā)現(xiàn)，不同BdGLRs具有不同的表達(dá)模式，暗示著BdGLRs與AtGLRs類似，負(fù)責(zé)不同的功能。研究發(fā)現(xiàn)BdGLR2.6、2.9和2.10在二穗短柄草苗期的表達(dá)量很少，甚至幾乎不表達(dá)，可能這3個(gè)基因表達(dá)具有時(shí)間特異性，在二穗短柄草的成熟期表達(dá)。其余16個(gè)BdGLRs成員雖然在苗期都表達(dá)，但不同的BdGLRs在不同的組織中表達(dá)。BdGLRs的功能很可能與AtGLRs類似，具有重要的生理功能，參與調(diào)控生物和非生物脅迫響應(yīng)、根的形態(tài)建成、種子萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)等。筆者后續(xù)會(huì)選擇在苗期高表達(dá)且在根、莖、葉都表達(dá)的BdGLR1.1、BdGLR2.1、BdGLR3.1和BdGLR3.5進(jìn)行深入研究。

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