新疆伊犁地區(qū)尼勒克縣人群泡球蚴感染病例調(diào)查及nad2、cob基因片段分析

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多房棘球蚴病(EM,echinococcosismultilocularis)是由多房棘球絳蟲引起的泡型包蟲病，也稱泡球蚴病(AE,alveolarechinococcosis)。世界范圍內(nèi)雖然該病的人群感染率遠沒有細粒棘球蚴病高，但是由于其較高的致死率和治療費用不菲等原因給感染人群和社會帶來了沉重的疾病負擔[1]。中國AE感染患者至少占到全球病例的91%以上[2]。新疆AE高危人群數(shù)量達到580萬，暴露人群感染率約為0.2%，每年新增病例約為811例[2]。AE病例在北疆地區(qū)散發(fā)流行，集中分布在伊犁、塔城和阿勒泰地區(qū)。伊犁地區(qū)尼勒縣自1989年開始至今陸續(xù)有AE感染病例的記載，近年來確診病例出現(xiàn)較明顯上升趨勢且受到了關注。為查明該縣感染病例構(gòu)成情況及病原類型，本研究收集確診病例檔案和感染組織樣本分別開展流行病學分析和病原核酸檢測。

1 材料與方法

1.1調(diào)查對象 由于伊犁地區(qū)尼勒克縣包蟲病病人診斷及手術治療基本集中在新疆北疆地區(qū)兩家包蟲病定點醫(yī)院：新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和伊犁哈薩克自治州友誼醫(yī)院，故收集兩家醫(yī)院于1989-2013年期間臨床確診或收治的泡球蚴感染病例檔案及部分手術切除病灶肝組織樣本用于開展相關研究。

1.2樣本收集及檢測 手術切除泡球蚴感染的人肝組織置于-80 ℃超低溫冰箱保存。取0.1 g組織切碎轉(zhuǎn)入離心管后加387 μL裂解液(50 mmol/L Tris, 0.1 mol/L EDTA, 0.1 mol/L NaCl, PH 8.0)，10 μL 20% SDS和3 μL蛋白酶K(20 g/L)，56 ℃孵育過夜。13 000 g離心10 min后，上清液轉(zhuǎn)入400 μL無水乙醇離心管中。高速離心15 min后棄上清液，用600 μL 75%乙醇高速離心5 min棄上清液后置于50 μL雙蒸水-20 ℃?zhèn)溆?。PCR擴增目的基因，擴增體系為1 μL DNA模板，8 μL dNTP，10 μmol/L引物各1 μL(Cob和Nad2基因)，1 μL Taq酶，5μL緩沖液，加水補足體系至50μL。PCR擴增程序為：變性95 ℃ 30 s，退火57 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 60 s，共35個循環(huán)。擴增引物序列分別為：cob基因部分片段：Emcob-F 5′-GTTTAAACTGGTAGATTGT GGTTC-3′，Emcob-R 5′-CTC CACAGTAGAAAT CACCATCA-3′；nad2基因部分片段：Emnad2-F 5′-GCGTTGATTCATTGATACA TTG T-3′，Emnad2-R 5′-T AGTAA AGCTCAAACCGAGTTCT-3′。擴增產(chǎn)物做凝膠電泳，出現(xiàn)目的條帶的擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，雙向測通。

1.3序列分析 應用BioEdit生物軟件進行序列拼接。使用DNASTAR 7.0軟件包 MegAlign軟件開展核苷酸或氨基酸同源性分析。使用MEGA6.0軟件包，以鄰接法(Construct/Test Neighbor-joining Tree)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，選擇棘球絳蟲屬其他絳蟲對應基因片段核苷酸序列作為外圍參考序列。

2 結(jié) 果

從1989-2015年間共確診來自尼勒克縣的AE感染患者48例，患者人群結(jié)構(gòu)特征如下。

2.1確診或收治尼勒克縣AE感染人群結(jié)構(gòu)分布

2.1.1確診時間分布 由圖1可見，尼勒克縣AE感染病例數(shù)從最初的(1989-1994年)的不足5例到近5年(2011- 2015年)的超過20例以上，尤其是近5年確診病例數(shù)出現(xiàn)較明顯的上升趨勢，占到總病例數(shù)的45.8%。該縣近5年人群AE年均確診率為1.7/10萬。

圖1 尼勒克縣AE感染病例確診年代構(gòu)成Fig.1 Diagnosis years distribution of the AE cases in Nileke County

2.1.2年齡構(gòu)成 由圖2可見，尼勒克縣泡球蚴感染病例在35-44歲年齡段較為集中，共19例，占所有病例數(shù)的38.6%，19歲以下年齡段未見有確診病例。

圖2 尼勒克縣AE感染病例年齡構(gòu)成Fig.2 Age distribution of the AE cases in Nileke County

2.1.3地區(qū)分布 由圖3可見，尼勒克縣AE感染病例主要集中在沿喀什河流域兩岸區(qū)域，除蘇布臺鄉(xiāng)和加哈烏拉斯臺鄉(xiāng)尚無收集到相關確診病例資料外，其余鄉(xiāng)鎮(zhèn)基本均有AE感染病例的存在，且尤以烏拉斯臺鄉(xiāng)感染病例最為集中，該鄉(xiāng)人口占全縣人口總數(shù)的5%左右，而病例比重卻占到了近30%。

圖3 尼勒克縣AE感染病例地區(qū)分布Fig.3 Geographical distribution of the AE cases in Nileke County

圖4 尼勒克縣AE感染病例職業(yè)構(gòu)成Fig.4 Occupation distribution of the AE cases

2.1.4性別及職業(yè)構(gòu)成 AE感染人群性別構(gòu)成比以男性占多數(shù)31例，占到64.6%；由圖4可見，職業(yè)構(gòu)成基本以農(nóng)牧民為主，占到95.8%。

2.1.5民族構(gòu)成 由圖5可見，尼勒克縣AE感染病例以哈薩克族為主，占到感染病例總數(shù)的54%。做相關性分析可見，不同民族間AE感染人數(shù)與本民族所占該縣人口比例具有相關性，R值為0.915(P值=0.011<0.05)。

圖5 尼勒克縣AE感染病例民族構(gòu)成Fig.5 Ethnical distribution of the AE cases in Nileke County

2.2泡球蚴基因檢測結(jié)果及分析 本次研究共收集來自尼勒克縣AE感染患者病灶肝組織樣本11份，提取DNA檢測nad2和cob基因片段，其中nad2和cob基因片段擴增長度分別為474 bp(nad2：nt192-665位點)和527 bp(cob：nt267-793位點)。測序結(jié)果顯示本研究中檢測11份樣本(China Xinjiang Nileke AE1-11)的兩個基因片段核苷酸序列各自完全同源。本研究樣本序列結(jié)果與 GenBank上獲得具有代表性的多房棘球蚴絳蟲nad2(18條基因)、cob(13條基因)片段開展核苷酸和氨基酸序列同源性比較。nad2：核苷酸序列同源性比較，本研究樣本與其他AE序列同源性達97.3%～100%之間；氨基酸序列同源性比較，本研究樣本與China Inner Mongolia(GenBank號：AB461411)、China Xinjiang Huochen(GenBank號：KT965454)和China Xinjiang Wuqia(GenBank號：KT965451)序列同源性均為99.4%，而與其他序列同源性為100%。cob：核苷酸序列同源性比較，本研究樣本與其他AE序列同源性在98.7% ～100%之間；氨基酸同源性比較，本研究樣本與其他序列完全同源，除外USA, Alaska(GenBank號：AB461400，與其同源性為99.4%)。

使用棘球絳蟲屬的另外4個種：細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)、少節(jié)棘球絳蟲(Echinococcusoligarthrus)、伏氏棘球絳蟲(Echinococcusvogeli)和石渠棘球絳蟲(Echinococcusshiquicus)相對應基因片段作為外圍參考序列，通過Mega 6.06軟件分別根據(jù)nad2和cob基因片段核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(見圖6、7)，系統(tǒng)發(fā)生樹可見基于nad2基因片段，本研究樣本與Japan Hokkaido(AB461 407)、China Qinghai(KT965466)、China Sichuan(AB461408)、China Xinjiang Xinyuan(KT965464)、和Kazakhstan(AB461406)親緣關系最近，而與Estonia(KT001425)、China Inner Mongolia (AB461411)親緣關系相對較遠；基于cob基因片段，本研究樣本與China Xinjiang Xinyuan(KT96547)、China QingHai(KT965487、KT965485)親緣關系最近，而與USA Alaska(AB461400)，China Inner Mongolia(AB461402)和Canada Saskatchewan(KC582620)親緣關系相對較遠。

圖6 基于線粒體nad2基因片段(474 bp)建立遺傳進化樹Fig.6 Phylogenetic relationships based on nad2 gene segment (474 bp) of mtDNA

圖7 基于線粒體cob基因片段(527 bp)建立遺傳進化樹Fig.7 Phylogenetic relationships based on cob gene segment (527 bp) of mtDNA

3 討 論

尼勒克縣轄1鎮(zhèn)10鄉(xiāng)2場，全縣總面積1.03萬平方公里，海拔在800～4 590米，地形東高西低，呈柳葉狀?？h境內(nèi)屬大陸性北溫帶氣候，山區(qū)地貌特征，四周高山環(huán)繞，峽谷遍布，中部有喀什河貫流全境。當?shù)厝丝诩s19萬人左右，男女性別比為105∶100，農(nóng)牧民人口占到73%左右，畜牧業(yè)生產(chǎn)方式主要還是一家一戶的飼養(yǎng)方式。

本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)從1989年開始尼勒克縣AE確診病例數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢，應當與AE診療水平的提高有關。病例數(shù)近5年上升尤為明顯，主要與尼勒克縣2009年成為中央轉(zhuǎn)移支付(新疆)包蟲病專項資金項目縣，當?shù)鼗颊呖梢韵硎艿矫赓M治療，就診人員增加有關。本研究通過分析AE感染病例的年齡、性別、職業(yè)及民族構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)感染人群以35～44歲，男性，哈薩克族牧民所占比例較大，除與相應人口基數(shù)所占比重較大有關以外，也可能與在這些條件下，AE感染暴露機率更多有關。從2016年開始伴隨著新疆全民健康體檢工程的實施，當?shù)爻青l(xiāng)居民每年可進行一次免費健康體檢，介時可能會從暴露人群中發(fā)現(xiàn)更多AE感染患者，因此各級醫(yī)療機構(gòu)在開展體檢篩查過程中應引起足夠的重視并在治療方面做好應對措施。另外AE感染潛伏期漫長，從感染至發(fā)病一般在10～15年[3]，現(xiàn)有診斷技術對早期感染還不足以發(fā)現(xiàn)[4]，需要研究人員利用免疫學及影像學等技術進一步改進和提升檢查水平。結(jié)合患者臨床體征、病灶組織形態(tài)學及血清免疫學在有些情況很難區(qū)分是否為AE感染，而分子生物學鑒定則解決了這一問題[5]，目前對棘球絳蟲進行分類的遺傳分子標記主要集中在線粒體基因[6]和核蛋白編碼基因[7]，本研究通過對樣本開展線粒體nad2和cob基因片段檢測和分析，發(fā)現(xiàn)尼勒克境內(nèi)包蟲病患者致病原均為AE且自身核酸序列較為單一，未有變異發(fā)生。與其他地區(qū)AE病原目的基因片段比較，核酸變異位點絕大多數(shù)為無義突變，尼勒克株兩個基因片段的核苷酸和氨基酸同源性均與內(nèi)蒙株相距較遠。

AE為自然疫源性疾病，野生動物參與AE的自然循環(huán)鏈。在中國境內(nèi)傳播宿主種類尤為復雜，終末宿主有狼、狐貍、犬等，中間宿主主要是包括部分鼠類在內(nèi)的小型哺乳動物[8]。尼勒克縣所在的伊犁河谷地帶生境類型復雜多樣，隨海拔不同會出現(xiàn)景觀、植被及潛在宿主動物種類分布的變化，區(qū)域內(nèi)病原及宿主具體如何分布以及是否會受到氣候、地理景觀等自然因素改變以及人為干預的影響，繼而發(fā)生病原傳播動力學改變；哪些宿主在AE向人群擴散方面發(fā)揮了主要作用，家犬是否參與其中；尤其是出現(xiàn)病例較多的烏拉斯臺鄉(xiāng)所在喀什河流域水源及土壤等外環(huán)境是否存在著大范圍的AE蟲卵污染；目前我們對阻斷細粒棘球蚴傳播采用的“犬犬投藥，月月驅(qū)蟲”的干預措施[9]是否適用于AE；與新疆相鄰的中亞鄰國哈薩克斯坦、吉爾吉斯坦及外蒙古也為AE重要的自然疫源地[10-12]，其境內(nèi)的病原遺傳特征、流行強度以及是否會出現(xiàn)跨境傳播。對于上述這些問題，目前我們尚缺乏足夠的認識，需要今后進一步開展相關科學調(diào)查和研究，尤其是通過利用景觀、生態(tài)結(jié)合地理遙感技術建立數(shù)學AE流行趨勢預測模型是當前研究的一個重要方向[13-14]，通過模型的建立起到識別導致AE流行的危險因素，預測潛在疫區(qū)、疾病流行強度及時空變化等作用，從而針對性優(yōu)化綜合防治措施，最終達到對AE的有效控制。

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