缺氧與腦膠質(zhì)細胞瘤的抗血管治療耐藥機制

陳石蕊 李金城 李子超 薛小燕 章薇 毛星剛* 章翔*

(第四軍醫(yī)大學: 1西京醫(yī)院神經(jīng)外科; 2學員隊三大隊一中隊;3學員隊二大隊二中隊;4藥學系藥理學教研室，陜西 西安 710032)

多形性膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是成人中最常見的原發(fā)惡性腦腫瘤，其中位生存期僅為1年左右[1]。豐富的血管發(fā)生及浸潤生長是GBM的典型病理特點，也是其手術難以完全切除、容易復發(fā)的因素[2]。目前除公認的化療藥物替莫唑胺(temozolomide, TMZ)外，近年來唯一獲得FDA批準使用腦膠質(zhì)瘤治療的抗血管藥物為貝伐單抗(Bevacizumab, BEV)[3]。BEV是重組的人源化血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)單克隆抗體。目前研究認為，VEGF是作用最為明顯的血管生長因子。GBM具有豐富的血管結構，其VEGF的表達水平較低級別膠質(zhì)瘤高出了約10倍，且其表達水平與腫瘤惡性程度及預后密切相關。由于VEGF同時具有抑制血管生成和水腫的作用，成為抗血管治療一個極具前景的靶點?？寡芩幬镌诙喾N實體瘤的治療中取得了一定的臨床療效。然而，抗血管治療尚存在爭議，其最大的問題是可導致腫瘤耐藥及浸潤性進展[4]。多數(shù)GBM患者經(jīng)抗血管治療后可有短暫的臨床緩解期，但最后出現(xiàn)腫瘤進展、耐藥，以致抗血管治療失敗。

GBM有原發(fā)和繼發(fā)性之分。原發(fā)性GBM生長迅速，通常不伴有IDH1突變；而繼發(fā)性GBM則生長緩慢，一般從低級別星形膠質(zhì)細胞瘤進展而來，常伴有IDH1突變。原發(fā)和繼發(fā)性GBM具有相同的病理組織學特點，包括明顯的細胞增殖、異型性、核分裂、壞死并常伴有偽柵欄樣結構(pseudopalisades)、豐富的異常血管結構等。GBM腫瘤細胞最初在正常血管附近聚集，以獲得其生長所需的氧和營養(yǎng)物質(zhì)。然而，隨著腫瘤迅速增殖，GBM細胞可破壞其周圍血管的完整性。血管的破壞導致瘤組織局部缺氧；另一方面，瘤細胞的快速生長可因距離最近的血管太遠而產(chǎn)生缺氧。這種缺氧環(huán)境可導致部分瘤細胞死亡；然而，還有一部分瘤細胞可存活并繼續(xù)增殖。缺氧環(huán)境更有利于腫瘤干細胞的存活。存活的GBM細胞激活眾多的信號通路如缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor, HIF)，最終使存活的細胞獲得適應低氧環(huán)境的能力，再次激活瘤組織中血管再生以及瘤細胞的惡性進展。

一、膠質(zhì)瘤干細胞與缺氧

越來越多的研究表明，在惡性血液病及實體腫瘤中(如皮膚癌，乳腺癌，結腸癌等)均存在腫瘤干細胞。其中，膠質(zhì)瘤干細胞(glioma stem cells, GSCs)具有無限的自我更新及重啟腫瘤生長的潛在能力[5]。極少量的GSCs種植到免疫缺陷小鼠的顱內(nèi)即可導致腫瘤的形成。由于GSCs對GBM的重要性，現(xiàn)今對其性質(zhì)進行了許多深入研究[6-7]。GSCs雖然具有異常的分化信號，但仍可表達可識別的細胞譜系特征：例如GSCs具有分化為星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元、及內(nèi)皮細胞的潛能。此外，GSC還系對放療及化療抵抗的重要工具。事實上，通過化學治療后存活的瘤組織中富含GSCs[8]。

膠質(zhì)細胞瘤組織中實際上包含了不同類型以及不同分化程度的細胞，因而，確切地標記出腫瘤內(nèi)GSCs有一定困難。如何定義并標記GSCs仍是一個值得探究的研究領域。目前有很多分子可用于GSCs定位，如Olig2、Musashi1、Sox2、Nestin和Nanog；還有一些細胞表面標記分子，包括CD44、CD15、α6整合素和CD133等。事實上，由于膠質(zhì)細胞瘤及GSCs的異質(zhì)性，沒有單一的分子可作為準確的GSCs標記物。大規(guī)模的全基因組分析指出：GBM 還可分為4個亞型，如前神經(jīng)亞型(Proneural, PN)，神經(jīng)亞型(Neural, NE)，經(jīng)典亞型(Classical, CL)以及間質(zhì)亞型(Mesenchymal, ME)[9]。這些不同的亞型不僅具有不同的基因組表達特點，也具有不同的臨床特征及干細胞特性：PN亞型的GSCs主要表達CD133標記，在體外培養(yǎng)時主要呈現(xiàn)為懸浮生長的神經(jīng)球樣干細胞；而ME亞型的GSCs細胞則表達CD44標記，在體外細胞培養(yǎng)時表現(xiàn)為半貼壁生長。PN亞型的腫瘤患者平均生存期比ME亞型的長一些。在對治療的反應方面二者也有差異，如：CD44+的腫瘤細胞對放療抵抗性更強，而對TMZ較為敏感；CD133+的瘤細胞正好相反，其對放療較為敏感，對放療則不敏感。另外，TMZ治療膠質(zhì)瘤的機制主要是通過甲基化O6位的鳥嘌呤而破壞DNA，但是GSCs表達O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)，該酶可移除烷基而阻止細胞死亡。膠質(zhì)瘤細胞MGMT啟動子甲基化導致的MGMT表達降低的患者預后較好。因此，MGMT啟動子甲基化可視為對TMZ敏感的一個因素。然而，GSCs在致病過程中還發(fā)展了與MGMT啟動子甲基化無關的其他耐藥機制，使得GSCs化療抵抗性的機制更為復雜化[10]。

缺氧對GSCs的生存以及增殖具有重要意義，它導致的多灶性壞死是GBM的標志性組織病理學特征之一。缺氧微環(huán)境對于GBM細胞進展、代謝、遷徙、浸潤和治療抵抗性均起著重要作用。腫瘤實質(zhì)內(nèi)壞死區(qū)周圍被致密的細胞所環(huán)繞，形成偽柵欄樣的微觀結構，是GBM特有的病理學特點。偽柵欄樣結構區(qū)域的瘤細胞高表達干細胞標記分子，富含GSCs樣細胞，因而這些缺氧區(qū)域是促進腫瘤細胞存活以及增殖的重要因素。研究指出，低氧環(huán)境可促進非膠質(zhì)瘤干細胞(non-GSCs)重編程為腫瘤干細胞，且對GSCs的自我更新具有重要作用。細胞對缺氧的反應主要由HIF家族轉錄因子介導，其中HIF2α的表達與缺氧水平呈正相關，且可上調(diào)CD133表達水平。HIF2α還可正向調(diào)節(jié)GSCs的自我更新能力及眾多干細胞因子的表達，包括Oct4、Sox2和c-Myc等。另外，缺氧也誘導HIF1α表達。采用基因沉默技術抑制HIF1α后可降低CD133+細胞的數(shù)量、并同時抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力。缺氧環(huán)境下HIF1α介導的GSCs干細胞狀態(tài)的維持依賴于Notch信號通路的激活[11]。事實上，沉默HIF1α或抑制Notch信號通路后均可干擾缺氧條件下GSC干細胞狀態(tài)的維持。此外，HIF1α可與Notch的胞內(nèi)結構域相互作用促進其穩(wěn)定性，從而激活Notch信號通路，其信號通路抑制劑可阻斷缺氧誘導的GSCs的存活以及侵襲性。

二、膠質(zhì)瘤干細胞與血管分化

在GSCs的眾多特點中，一個值得注意的是GSCs具有分化為血管內(nèi)皮細胞和周細胞的潛能[12]。正常人類血管是一種高度結構化的動態(tài)系統(tǒng)，可為細胞、組織遞送營養(yǎng)物質(zhì)并運輸細胞產(chǎn)物。然而，與正常組織不同，膠質(zhì)瘤組織中的血管結構在形態(tài)和功能上都極為異常，其通透性較高，細胞的結構化差，且其構成的血腦屏障功能不完整。這些特點使得膠質(zhì)細胞瘤中血管的運氧功能障礙，從而導致腫瘤局部缺氧。正常組織中的血管形成主要通過血管發(fā)生和血管再生，血管發(fā)生一般是在發(fā)育過程中通過內(nèi)細胞分裂增殖而形成，而血管再生一般指在已有血管基礎上通過出芽方式形成新的血管。另外在膠質(zhì)瘤中，還存在獨特的異常血管發(fā)生情況，包括血管共生(vascular co-option, VCO)和血管擬化(vasculogenic mimicry, VM)[13]。

GSCs對膠質(zhì)細胞瘤中血管發(fā)生具有多方面的作用：首先，CD133+的GSCs高表達VEGF，VEGF不僅可促進內(nèi)皮細胞遷移、增殖并形成血管結構，還可促使局部內(nèi)皮細胞活性，從而募集骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞形成血管。更重要的是， GSCs本身可作為血管腔壁成分參與血管形成,這種現(xiàn)象成為腫瘤細胞的VM。參與VM的細胞一般是具有高度浸潤性的瘤細胞。其次，人們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中的血管內(nèi)皮細胞具有瘤細胞的特點，尤其是具有與腫瘤細胞一致的基因組突變，提示其與腫瘤細胞具有相同來源。更多的研究表明，CD133+的GSCs可分化為中間體的CD133+/CD144+細胞，并進一步分化為成熟CD144+內(nèi)皮細胞，所分化的內(nèi)皮細胞高表達內(nèi)皮細胞特異性因子CD105、CD31、CD34和VEGFR-2[14]。這些結果表明：GSCs具有向內(nèi)皮細胞轉化的潛能，從而參與腫瘤中的血管發(fā)生。

在正常腦及腫瘤組織中，血管周細胞是血管結構的重要組成部分。最新的研究指出，GSCs還可分化為血管周細胞，從而促進腫瘤中的血管形態(tài)及功能的形成。事實上，GBM腫瘤組織中的絕大部分血管周細胞都來源于轉化的腫瘤細胞[15]。通過基因技術特異性的消除血管周細胞后，可抑制腫瘤中的血管形成并抑制腫瘤生長。有研究指出，血管周細胞向內(nèi)皮細胞的遷移主要通過SDF-1/CXCR4信號軸實現(xiàn)，而GSCs向血管周細胞的分化依賴于TGF-β信號通路[15]。另外，Notch信號通路和HMGA2也對GSCs向血管周細胞分化發(fā)揮重要作用[16]。

三、缺氧參與調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞瘤血管發(fā)生

缺氧不僅調(diào)節(jié)GSCs的存活與增殖等腫瘤生物學性質(zhì)，還與GBMR的血管發(fā)生密切相關[17-18]：①缺氧可使多種血管發(fā)生因子表達上調(diào)(如VEGF、FGF、ADM、ZNF395等)；②缺氧可促進GSCs干細胞狀態(tài)維持及增殖，并促進GSCs分泌血管發(fā)生因子[19]；③缺氧可促進GSCs的血管擬態(tài)或向血管細胞(包括內(nèi)皮細胞和周細胞)分化，直接參與GBM中的血管發(fā)生[14-15,20]。例如，缺氧可促進GSCs表達內(nèi)皮細胞標記物CDH5/CD144，并促進其形成血管樣管腔結構[20]。缺氧可調(diào)控大量基因表達，這些基因組成一個復雜的分子網(wǎng)絡，此分子網(wǎng)絡中的重要基因包括缺氧誘導因子(HIF1α和HIF2α)、缺氧激活的細胞毒素、糖酵解代謝途徑、浸潤及遷徙相關分子、非折疊蛋白反應等，其功能涉及血管發(fā)生、耐藥性、干細胞維持、糖酵解代謝、細胞增殖、遷徙及浸潤性等多方面生物學功能[21]。因而，以腫瘤缺氧反應作為治療靶點成為具有潛力的研究方向。

四、抗血管治療及其耐藥性

由于在正常人體組織中血管發(fā)生并不活躍，因此針對血管發(fā)生的抗血管治療成為具有相對腫瘤特異性的重要策略。目前抗血管治療的方案主要包括給予或過表達血管發(fā)生抑制因子，如針對VEGFA及其受體的各種中和抗體、干擾內(nèi)皮細胞功能和抑制促血管發(fā)生因子的產(chǎn)生等。

在眾多的促進血管發(fā)生的機制中，VEGF是目前研究最清楚的促進血管發(fā)生相關的信號通路。關于VEGF家族生長因子的成員、結構、功能以及表達的調(diào)節(jié)已經(jīng)做了深入研究。膠質(zhì)瘤中的許多成分都可以產(chǎn)生VEGF，如腫瘤細胞、腫瘤基質(zhì)、炎癥細胞及內(nèi)皮細胞等。VEGF可刺激瘤組織中內(nèi)皮細胞表達VEGF受體(VEGFR)，從而促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移和存活，并形成管腔結構。它還具有血管擴張作用，可增加血管通透性而加重腫瘤組織中的間隙壓力。VEGF亦可促進內(nèi)皮細胞分泌一氧化氮(nitric oxide, NO)合酶(nitric oxide synthase, NOS)，導致NO含量增加，而NO具有血管擴張作用。VEGF的這些作用是GBM腫瘤中形成異常血管及不完善的血腦屏障的重要因素，也因此而成為重要的抗血管治療靶點。其中BEV是人工重組的VEGF單克隆抗體，可以阻止VEGF與受體的相互作用。BEV最初被批準用于治療轉移性結腸癌，隨后用于治療非小細胞肺癌、轉移性腎細胞癌、子宮頸癌、對鉑耐藥的卵巢癌等多種腫瘤的化療。

雖然BEV在許多腫瘤的治療中都取得了一定效果，但其對膠質(zhì)細胞瘤的治療還存在一些問題。BEV可使膠質(zhì)細胞瘤患者病情得到緩解，但對于延長患者生存期并無顯著效果。與其他一些抗腫瘤藥物類似，BEV會很快導致瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，認為BEV使瘤細胞耐藥的一個重要機制是其可致GBM細胞的上皮細胞-間質(zhì)轉型(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。另外BEV的使用可激活不依賴于VEGF的其他血管發(fā)生途徑，如，BEV治療可致其他促進血管再生相關因子的表達，包括bombina variegate peptide 8(BV8)、FGF1/2、IL-8等[22]。其次，缺氧環(huán)境可促進GSCs向內(nèi)皮細胞或血管周細胞的分化，從而促進腫瘤細胞的血管擬態(tài)。由于BEV治療耐藥發(fā)生時腫瘤組織內(nèi)再次產(chǎn)生缺氧環(huán)境，而在缺氧環(huán)境下，GSCs可高表達血管內(nèi)皮細胞標記分子CD144，并促進GSCs的血管擬態(tài)能力[20]。顯然，BEV在治療早期可以逆轉腫瘤組織內(nèi)異常的血管使之正常化，改善瘤組織內(nèi)的氧氣狀況，緩解缺氧環(huán)境所致的瘤細胞侵襲性。腫瘤的EMT則與缺氧環(huán)境密切相關。如缺氧可致MET表達升高，并通過MET/VEGFR2信號通路致EMT增強膠質(zhì)細胞瘤的侵襲性[23]。盡管如此，對于BEV耐藥機制的產(chǎn)生尚不完全清楚，由于抗血管的潛在治療前景，對耐藥機制的深入研究具有重要意義[22]。

五、展望

抗血管治療在多種腫瘤的治療中取得了一定的治療效果，其對膠質(zhì)細胞瘤的治療具有潛在的應用前景。抗血管治療的機制是通過抑制腫瘤中的血管發(fā)生，使瘤組織發(fā)生缺血、缺氧性壞死而抑制瘤細胞生長。作為GBM中的重要微環(huán)境因素，缺氧可通過調(diào)控大量分子的表達，影響腫瘤的血管發(fā)生[20]、浸潤性進展等生物學特性。目前抗血管治療以及聯(lián)合其他治療策略的臨床研究已經(jīng)開展，有一部分在臨床前期研究中取得了一定效果。作為膠質(zhì)細胞瘤耐藥性及浸潤性進展的重要因素[24]，缺氧可調(diào)控大量分子表達，這些分子相互作用形成一個復雜的分子網(wǎng)絡。針對缺氧調(diào)控網(wǎng)絡研究相應治療靶點，有助于理解抗血管治療耐藥產(chǎn)生的機制，并最終為避免耐藥產(chǎn)生、提高膠質(zhì)細胞瘤抗血管治療效果提供理論與臨床應用基礎。