脂肪組織長期儲存的研究進(jìn)展

張佩祺 綜述 周雙白 李青峰 審校

【提要】 自吸脂術(shù)出現(xiàn)以來，使用脂肪組織進(jìn)行軟組織填充已成為臨床常見的治療方法。但目前臨床仍存在一處填充需要多次移植的情況。如能一次抽吸后對脂肪進(jìn)行妥善保存，并在需要時進(jìn)行再次注射，就可以減少抽脂次數(shù)，減輕患者痛苦。因此，對脂肪組織進(jìn)行長期儲存并減少其重吸收率具有重要的臨床意義。本文就脂肪組織長期儲存的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

自體脂肪移植填充是目前臨床常用的軟組織填充方法。脂肪組織具有來源豐富、操作簡單、無排異反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于瘢痕填充、創(chuàng)傷引起的面部萎縮[1]、Romberg病[2]、皺紋及乳房填充[3]等方面，是美容或修復(fù)領(lǐng)域的常用技術(shù)。

但脂肪移植存在重吸收問題，留存率僅30%～60%[4]。即使在細(xì)胞輔助移植等技術(shù)的幫助下，可提高脂肪留存效率，但目前大部分情況下仍需要多次進(jìn)行脂肪移植，以達(dá)到精確的修復(fù)效果[5]。如能長期保存抽取的脂肪，可減少脂肪抽吸次數(shù)，減輕患者痛苦，并提高治療效率。因此，脂肪的長期儲存成為了脂肪移植治療中的重要課題。本文將從冷凍溫度、保存方式及冷凍保護(hù)劑使用等方面，對現(xiàn)有的脂肪組織保存方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 脂肪組織與細(xì)胞保存的不同及難點(diǎn)

目前，細(xì)胞凍存技術(shù)已經(jīng)比較成熟，一般多為加入凍存保護(hù)劑后進(jìn)行程序降溫或玻璃化降溫。在保存細(xì)胞時，由于細(xì)胞多為分散的單個細(xì)胞或幾個細(xì)胞聚集的小團(tuán)塊，因而在添加冷凍保護(hù)劑后可以與保護(hù)劑充分混勻，達(dá)到較好的保護(hù)效果。且細(xì)胞保存僅涉及單一細(xì)胞的保存，在選擇凍存方法及凍存保護(hù)劑時均只需考慮該細(xì)胞的特性，因而選擇較固定且單一。

而保存脂肪組織的難度則大于保存細(xì)胞，主要因為①脂肪組織為顆?；驁F(tuán)塊，在與冷凍保護(hù)劑混合時難以使保護(hù)劑完全滲透入組織團(tuán)塊內(nèi)部，導(dǎo)致顆粒中心部分的細(xì)胞或組織難以得到充分保護(hù)，凍存后的細(xì)胞活性也會因此受到較大影響；②組織保存涉及多種細(xì)胞，目前的研究中，構(gòu)成較復(fù)雜的組織的保存仍處于探索階段[6]。脂肪組織含有脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞及血管組織，因而在保存液的選擇及凍存方法上仍未形成共識。

2 脂肪長期儲存的新進(jìn)展

目前常用的脂肪組織凍存法為程序降溫法，復(fù)蘇則采用快速復(fù)溫法。流程如下：①將脂肪組織進(jìn)行低速離心，分離上層油脂及下層腫脹液；②將脂肪組織與凍存保護(hù)劑混合后分裝入冷凍管中；③將冷凍管置于梯度凍存盒，以每分鐘降溫10℃的速率[7]進(jìn)行降溫，待降至-80℃后移至液氮中進(jìn)行長期保存；④復(fù)蘇時將冷凍組織取出后直接置于37℃水浴中進(jìn)行快速復(fù)蘇。

該方法主要參照細(xì)胞保存的方式，在保存脂肪組織時仍存在問題。快速冷凍法及等溫玻璃化法也被應(yīng)用于組織保存，但其效果仍未明確。

2.1 溫度對脂肪保存的影響

細(xì)胞和組織長期體外保存最主要的手段為低溫冷凍保存，冷凍保存生物樣本對于細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)酶的活性維持均有較好作用。保存溫度從4℃至-196℃（液氮）之間均有使用。在脂肪組織保存上，對于溫度的不同選擇是否會影響脂肪細(xì)胞活性及移植后重吸收率仍無定論。

一般認(rèn)為，凍存溫度越低組織活性保留越好。但Shoshani等[8]將脂肪組織于-18℃中凍存2周后注射至裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞活性與成活率接近新鮮脂肪組織。Moscatello等[9]將脂肪組織分別儲存于-20℃及液氮中，液氮組的脂肪細(xì)胞活性及ADSC活性均高于-20℃組。Wolter等[10]發(fā)現(xiàn)，于-80℃中凍存的脂肪組織，其脂肪細(xì)胞活性高于在-20℃中凍存的脂肪組織，且移植后成活率更高；如有冷凍保護(hù)劑存在，則成活比例更高。Atik等[11]將脂肪組織分別冷凍于-35℃與液氮中6個月，前者明顯出現(xiàn)脂肪細(xì)胞數(shù)量減少、脂肪空泡及纖維變性等問題，后者保存效果較好。

但是，與上述結(jié)果不同，MacRae等[12]將脂肪組織分別冷凍于-20℃及液氮中，未見兩組細(xì)胞活性有明顯差異。Li等[13]將脂肪組織加入羥乙基淀粉后，分別凍存于-20℃、-80℃和-196℃中，脂肪細(xì)胞活性均無明顯差異。Erdim等[14]在4℃下存儲脂肪細(xì)胞2周，其活性大于-20℃或-80℃冷凍條件下的脂肪細(xì)胞，雖相比新鮮脂肪組織活性略有下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異。Lidagoster等[15]也得出與此相近的結(jié)論并指出，相較于1℃保存的脂肪組織，-16℃保存下的組織會有更明顯的炎癥反應(yīng)和組織壞死，不利于脂肪移植后的存活。由于液氮保存大量脂肪組織的高成本限制了其臨床應(yīng)用，以上結(jié)果提供了可使用商業(yè)型冰箱儲存脂肪組織的證據(jù)，降低成本的同時也增加了低溫冷凍法長期保存脂肪組織在臨床上應(yīng)用的可行性。

值得注意的是，以上研究均存在一個共同的問題，組織保存和移植后觀察時間均較短，溫度對長期保存脂肪的活性和移植后效率的影響仍需進(jìn)一步研究。

2.2 凍存方式對脂肪保存的影響

現(xiàn)階段常用的凍存方式主要分為慢速凍存法（程序凍存法）和快速凍存法（玻璃化凍存法）。

慢速凍存法作為傳統(tǒng)的凍存方法在細(xì)胞和組織儲存上已經(jīng)使用多年，技術(shù)較為成熟。常用的步驟為將脂肪組織進(jìn)行預(yù)處理后（通常添加冷凍保存劑），在12 h內(nèi)以較慢速度降至-80℃，再移至液氮中進(jìn)行儲存。慢速凍存法具有安全、降低組織損耗等特點(diǎn)，對復(fù)合組織的生物活性具有較好的保護(hù)作用[16]。Conti等[7]將新鮮脂肪組織以慢速冷凍法降溫后置入液氮中凍存，2周后于小鼠皮下進(jìn)行脂肪移植，移植1周后MRI顯示脂肪吸收明顯，但人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSC）的再生與分化能力未受明顯影響。Minonzio等[17]認(rèn)為，慢速冷凍法凍存的ADSC分化能力和增殖能力無明顯異常。由于慢速冷凍法會在降溫過程中產(chǎn)生大量結(jié)晶，同時出現(xiàn)滲透壓的改變。冰晶會對細(xì)胞產(chǎn)生一定的機(jī)械損傷，而滲透壓會使細(xì)胞膜出現(xiàn)皺縮，影響細(xì)胞復(fù)溫后的性能。

快速凍存法也被稱為玻璃化凍存法，是將組織置于高濃度的凍存保護(hù)劑中，然后直接放入液氮中進(jìn)行凍存[18]。脂肪組織的玻璃化凍存暫無明確的研究結(jié)果，但是其他組織，如胚胎[19]、精子[20]、卵母細(xì)胞[21]等，均有證據(jù)表明快速凍存法對組織和細(xì)胞活性的保存更好。玻璃化凍存雖然對組織活性的保存有效，且相比于慢速凍存法更節(jié)省時間和凍存空間，但高濃度的凍存保護(hù)劑帶來的細(xì)胞毒性問題仍不能忽略。

除以上兩種已較為常見的凍存方式外，近年來新興的一種方法為等溫玻璃化，即將樣品置于高濃度的糖、多元醇及有機(jī)聚合物中，在室溫下進(jìn)行干燥處理。過程中不會結(jié)冰，但生化反應(yīng)停止，樣本可以免受低溫?fù)p傷[22]。低溫會引起酶活性降低，活性氧的清除隨之減弱，導(dǎo)致脂肪發(fā)生過氧化反應(yīng)，減少脂肪細(xì)胞的活性或引起脂肪組織的纖維化，影響脂肪移植效果[23-24]。這種新興的、無需冷凍的方法還需要更多的研究來證實其對脂肪組織的保存效果。

2.3 冷凍保護(hù)劑對脂肪組織保存的作用

冷凍保護(hù)劑是在低溫凍存過程中，保護(hù)細(xì)胞免受低溫后水分子結(jié)晶的破壞而添加的溶劑，一般分為滲透性和非滲透性兩種。前者多為小分子中性物質(zhì)，弱化水結(jié)晶過程，減少對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，包括甘油、DMSO、丙二醇等溶劑。非滲透性保護(hù)劑多為大分子，通過降低溶質(zhì)濃度減少低溫冷凍對細(xì)胞造成的損傷，包括氨基酸、聚乙二醇、白蛋白、羥乙基淀粉等。

肖斌等[24]發(fā)現(xiàn)，脂肪組織在不同的凍存條件下，需不同的凍存保護(hù)劑才能達(dá)到較好的細(xì)胞保護(hù)效果。-80℃凍存時，添加15%DMSO的細(xì)胞活性較高；-196℃凍存時，添加15%DMSO＋6%丙二醇的細(xì)胞活性較高。仇侃敏等[25]的研究表明，相同凍存條件下，胎牛血清（FBS）+8%DMSO相比于無血清凍存液更有利于保持脂肪細(xì)胞活性，并明顯提高復(fù)溫后的存活率及移植后成活率。另有研究顯示，加入DMSO+海藻糖的脂肪組織凍存后，相對比于新鮮脂肪組織，成活脂肪細(xì)胞數(shù)量僅少量減少，而相比于未加入保護(hù)劑組，存活細(xì)胞數(shù)量明顯提高，且組織收縮率明顯減低；在動物實驗中，3組均出現(xiàn)組織重吸收現(xiàn)象，但加入凍存保護(hù)劑組明顯小于未加入組，且未加入保護(hù)劑的脂肪組織中出現(xiàn)大量纖維化組織，影響術(shù)后效果[26]。

但大多數(shù)保護(hù)劑均存在一定的細(xì)胞毒性，如15%的DMSO有利于保存脂肪組織活性及移植后成活率[27]，但具有細(xì)胞毒性作用，復(fù)溫后需經(jīng)多次洗脫，才可進(jìn)行移植，增加了手術(shù)成本。

非活體實驗中，在慢速凍存及快速復(fù)溫的條件下，海藻糖可單獨(dú)作為凍存保護(hù)劑應(yīng)用于脂肪組織的低溫保存，因海藻糖無細(xì)胞毒性，洗脫時可減少步驟及耗時[28]。

3 總結(jié)與展望

脂肪保存在多年來的研究中已經(jīng)有了一定的進(jìn)展，但仍有很多問題需要解決。目前的研究中，大多數(shù)實驗都為離體的細(xì)胞學(xué)實驗或動物實驗，仍需更多臨床研究來提供更確切的研究數(shù)據(jù)。已有的研究結(jié)果表明，脂肪組織的保存可選擇較高的溫度；凍存保護(hù)劑的選擇上，無毒、無異種抗原、易洗脫是今后發(fā)展的方向；DMSO及FBS應(yīng)被更安全的材料替代。