蒙藥黃連-4湯對(duì)心肌缺血再灌注損傷SD大鼠cTn-I、CK、LDH的保護(hù)作用

金哈布日，李 平，張青山*，布仁巴圖*

（1．內(nèi)蒙古民族大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究生，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2．內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

當(dāng)前，隨著社會(huì)不斷發(fā)展，物質(zhì)水平的高速提高，不健康的飲食習(xí)慣、大量的吸煙和飲酒、長(zhǎng)期缺乏運(yùn)動(dòng)以及精神上的壓力使我國(guó)心血管疾病的發(fā)病率不斷攀升[1]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injuty ，MIRI）是一種心肌缺血后加重原有的損傷，引起心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生不可逆性改變，進(jìn)而加重原有的心血管病，最終導(dǎo)致患者病情惡化甚至死亡的疾病[2]。蒙藥黃連-4湯是蒙醫(yī)傳統(tǒng)方劑之一，是由黃連、梔子、瞿麥、多葉棘豆組成，具有清熱解毒、防止燥濁熱、調(diào)理赫依齊素相搏之功效。君藥黃連的性質(zhì)為苦、寒、無(wú)毒，具有清熱燥濕，瀉火解毒、調(diào)理體素、瀉火除煩、改善心臟赫依、齊素循環(huán)，調(diào)節(jié)免疫功能、改善心血管功能、降血壓、抗血小板等功效，在這一基礎(chǔ)上加以辨證施治。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究蒙藥黃連-4湯對(duì)大鼠心肌再灌注損傷后心肌酶及肌鈣蛋白I的變化，進(jìn)一步探討蒙藥黃連-4湯的應(yīng)用對(duì)心肌再灌注損傷大鼠心臟的保護(hù)作用機(jī)制。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物：選用清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體重約（280±20）g，大鼠飼養(yǎng)于適宜溫度和濕度的動(dòng)物室中，相同飼養(yǎng)環(huán)境且自由飲食，自然晝夜（術(shù)前12 h禁食水）。（由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)碼為：SCXK（遼）2015-0001）。

主要試劑及使用藥品：蒙藥黃連-4湯（由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)制劑）；丹參片（南京厚生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）；磷酸肌酸激酶（CK）試劑盒（SOOOO-96T）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（SOOOO-96T）；肌鈣蛋白（cTn-I）試劑盒（SOOOO-96T）；水合氯醛（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）。

主要儀器：電熱恒溫培養(yǎng)箱（BDR-82，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；心電圖機(jī)（成都泰盟軟件有限公司）；HX-300S動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟軟件有限公司）；BL-420S生物技能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）。全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（MULTISKANMK3，wELLWASH4MKZ芬蘭）；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法

60只正常成年雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，正常飲食，體重約（280±20）g，每組10只隨機(jī)分成6組：假手術(shù)組、模型組、黃連-4湯底劑量組、黃連-4湯中劑量組、黃連-4湯高劑量組、丹參組。假手術(shù)組和模型組灌胃等容積生理鹽水，黃連-4湯成人（60KG）劑量為3 g/kg·d，低、中、高劑量組分別于成人的6、12、18倍（0.04 g/kg·d、0.08g/kg·d、0.16 g/kg·d），陽(yáng)性對(duì)照組給予丹參0.04 g/kg·d，各組灌胃每天1次，灌胃15天。

1.2.2 心肌缺血再灌注損傷模型建立

按文獻(xiàn)[3]方法加以改進(jìn)后進(jìn)行造模。術(shù)前15分鐘大鼠用10%水合氯醛（300mg·kg-1）腹腔注射麻醉，大鼠麻醉成功后仰臥位固定，大鼠頭部上仰，在氣管處剪毛后切開(kāi)頸部暴露，剝離甲狀腺切開(kāi)氣管，置氣管套管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，正壓通氣（呼吸頻率70～80次/min，呼吸比3:2，潮氣量0.002～0.003 L），大鼠四肢皮下插入電極，連接BL-420S生物技能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，持續(xù)記錄Ⅱ?qū)?lián)的心電圖。大鼠胸部剪毛后在胸骨左緣橫向切開(kāi)皮膚，沿著第3、4肋間逐層打開(kāi)胸腔，暴露心臟，用6-0無(wú)損傷真絲線于左心耳下約2～3 mm處，穿過(guò)心臟表層結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支（深度約1.5 mm），致心肌缺血30 min拆線后再灌注90 min。假手術(shù)組只穿線不予結(jié)扎處理。心肌缺血時(shí)肉眼可看到局部心臟肌肉組織蒼白或發(fā)紺，以Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段太高或者T波異常，心肌再灌注損傷時(shí)缺血區(qū)心肌組織轉(zhuǎn)紅，太高的ST段降低50%以上可判斷為心肌缺血模型成功。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測(cè)

各組大鼠均再灌注90 min后，腹主動(dòng)脈取血（約3 mL），離心15 min（3000 r·min-1，4℃），取上清放入-80℃冰箱凍存?zhèn)溆茫瑴y(cè)定血清LDH、CK、cTn-I等生化指標(biāo)，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本次數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料以例（n），百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蒙藥黃連-4湯對(duì)大鼠MIRI血清LDH水平的影響

與假手術(shù)組相比較：模型組血清LDH的水平顯著性升高（P＜0.05）；與模型組相比較：黃連-4湯各劑量組均使血清LDH水平降低，以黃連-4湯高劑量組最為顯著（P＜0.05）；與丹參組相比較：黃連-4湯高劑量組血清LDH產(chǎn)生顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 蒙藥黃連-4湯對(duì)大鼠MIRI血清CK水平的影響

與假手術(shù)組相比較：模型組血清CK的水平顯著性升高（P＜0.05）；與模型組相比較：黃連-4湯各劑量組均使血清CK水平降低，以黃連-4湯高劑量組最為顯著（P＜0.05）；與丹參組相比較：黃連-4湯高劑量組血清CK產(chǎn)生顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 蒙藥黃連-4湯對(duì)大鼠MIRI血清肌鈣蛋白cTn-I水平的影響

與假手術(shù)組相比較：模型組血清cTn-I的水平顯著性升高（P＜0.05）；與模型組相比較：黃連-4湯各劑量組均使血清cTn-I水平降低，以黃連-4湯高劑量組最為顯著P＜0.05）；與丹參組相比較：黃連-4湯高劑量組血清cTn-I產(chǎn)生顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 心肌缺血再灌注后血清CK、LDH、cTn-I水平的影響（±s，n=10）

表1 心肌缺血再灌注后血清CK、LDH、cTn-I水平的影響（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較：P＜0.05；與模型組比較：P＜0.05

實(shí)驗(yàn)分組 CK LDH cTn-I假手術(shù)組 25.65±2.77 1.35±0.15 1.36±0.10模型組 34.72±4.87 1.76±0.17 1.65±0.13黃連-4湯底劑量組 33.11±3.81 1.69±0.15 1.61±0.18黃連-4湯中劑量組 31.26±2.94 1.56±0.17 1.51±0.18黃連-4湯高劑量組 26.77±2.89 1.34±0.14 1.37±0.11丹參組 27.37±3.94 1.38±0.20 1.45±0.09

3 討 論

心臟作為機(jī)體的發(fā)動(dòng)機(jī)，其自身組織結(jié)構(gòu)和生理功能的完整性時(shí)時(shí)刻刻影響著機(jī)體生老病死過(guò)程中的每一分鐘。因此預(yù)防和治療冠狀動(dòng)脈血流再灌注后造成的損傷與心肌梗死的研究愈來(lái)愈受到廣大學(xué)者們的關(guān)注。大量研究顯示，MIRI會(huì)進(jìn)一步加大心肌缺血及心功能障礙的程度，甚至比急性心肌梗死嚴(yán)重，且病死率高[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)MIRI的發(fā)生機(jī)制包括再灌注性心肌酶、肌鈣蛋白漏出增多[5-6]，心肌再灌注損傷時(shí)心肌細(xì)胞膜通透性增加，從而使心肌中數(shù)量較多的CK、LDH等心肌酶大量漏入到血液當(dāng)中，使血清中CK、LDH的濃度升高[7]。本次實(shí)驗(yàn)中大鼠血清CK指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明，MIRI模型組的CK值比較高，與假手術(shù)組和藥物組比較后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蒙藥黃連-4湯組大鼠血清中的 CK值比模型組較低，說(shuō)明蒙藥黃連-4湯能有效地抑制ATP和肌酸之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng)，延緩或減輕心肌細(xì)胞中肌酸激酶的漏出目前認(rèn)為在心梗時(shí)測(cè)定CK的活性比做心電圖更有臨床價(jià)值[8-9]。LDH作為一種糖酵解酶[10]，半壽期是10-163 h，在臨床上多用于回顧性診斷，本次實(shí)驗(yàn)中大鼠血清LDH指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明，大鼠MIRI模型組中 LDH的活性顯著升高，說(shuō)明心肌細(xì)胞損傷時(shí)漏出的LDH增多，而蒙藥黃連-4湯組中的LDH活性低于模型組，說(shuō)明蒙藥黃連-4湯有效地抑制心肌細(xì)胞內(nèi)LDH的漏出，其抑制途徑可能與調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平相關(guān)。現(xiàn)認(rèn)為cTnI為心肌中具有高度特異性的小分子量蛋白，當(dāng)心肌受損時(shí)能夠更早并且更易漏出入血液當(dāng)中，而且在血液中維持的時(shí)間也較長(zhǎng)，因cTnI具有高度的靈敏性和特異性，所以心肌缺血再灌注后檢測(cè)血液中cTnI的含量可作為心肌損傷的重要指標(biāo)[6]。并且cTn-I在血清中的含量極其微少，且具有基因編碼的特異性[11]，本次實(shí)驗(yàn)中黃連-4湯組大鼠血清中cTn-I含量低于MIRI模型組（P＜0.01），說(shuō)明黃連-4湯組能有效減輕心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞及壞死程度，從而使cTn-I釋放入血的量明顯降低，為缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞功能的修復(fù)起到一定的有效作用。

眾所周知，傳統(tǒng)蒙藥在治療各不同類心血管疾病中有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。除君藥黃連之外，主要成分梔子具有瀉火除煩，清熱利尿，涼血散瘀作用，瞿麥有利尿通淋，破血通經(jīng)作用，多葉棘豆有殺"粘"蟲(chóng)，清熱，燥"希日烏素"，愈傷，生肌，止血，消腫，通便等作用。因此蒙藥黃連-4湯能夠抑制心肌缺血再灌注損傷CK、LDH、cTn-I的水平從而達(dá)到大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。而本實(shí)驗(yàn)研究是首次對(duì)蒙藥黃連-4湯在心肌缺再灌注方面血進(jìn)行了藥效學(xué)研究，增加并明確了蒙藥黃連-4湯在心肌缺血再灌注損傷方面的臨床主治范圍，在臨床上增加了治療心肌缺血再灌注損傷的用藥選擇。

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