用全內(nèi)反射瞬逝場(chǎng)照明磁鑷研究Bloom解旋G-四聯(lián)體?

趙振業(yè) 徐春華 李菁華黃星榞 馬建兵 陸穎

1)(中國(guó)科學(xué)院物理研究所,軟物質(zhì)物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190)

2)(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)物理學(xué)院,北京 100190)

3)(廣東工業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院,廣州 510006)

用全內(nèi)反射瞬逝場(chǎng)照明磁鑷研究Bloom解旋G-四聯(lián)體?

趙振業(yè)1)2)徐春華1)2)李菁華3)黃星榞1)2)馬建兵1)2)陸穎1)2)?

1)(中國(guó)科學(xué)院物理研究所,軟物質(zhì)物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190)

2)(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)物理學(xué)院,北京 100190)

3)(廣東工業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院,廣州 510006)

Bloom解旋酶,G-四聯(lián)體,全內(nèi)反射,磁鑷

1 引 言

G-四聯(lián)體(G-quadruplex,G4)是由富含串聯(lián)重復(fù)鳥(niǎo)嘌呤(G)的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸折疊形成的特殊結(jié)構(gòu).它是由Hoogsteen鍵連接,其中還需要一價(jià)陽(yáng)離子(Na+或K+)來(lái)維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,如圖1(a)所示.迄今為止認(rèn)為在DNA中有多種G4結(jié)構(gòu)[1],這些結(jié)構(gòu)受一價(jià)陽(yáng)離子、尾鏈的長(zhǎng)度及序列和三條G4鏈的連接環(huán)(loop)所影響[2].端粒末端的G4是目前研究得較為透徹的一種G4結(jié)構(gòu).在鈉溶液(Na+)環(huán)境中G4只有一種反平行結(jié)構(gòu)[3],而在鉀溶液(K+)環(huán)境中則有三種較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)(hybrid1,hybrid2,two layer parallel)[4].而進(jìn)一步的研究認(rèn)為在端粒末端的G-四聯(lián)體主要有兩種結(jié)構(gòu)[5].文獻(xiàn)[6,7]報(bào)道了失去一條鏈的G4也可以穩(wěn)定存在,被稱為G-triplex(G3).端粒的G4對(duì)染色體DNA的復(fù)制及穩(wěn)定性起重要作用[8],存在于調(diào)控序列的G4結(jié)構(gòu)對(duì)基因表達(dá)、免疫調(diào)節(jié)等也有著至關(guān)重要的作用[9,10].

RecQ解旋酶是一種廣泛存在于原核生物到真核生物的DNA解旋酶,在基因組穩(wěn)定方面有著重要的作用[11]. 人的細(xì)胞內(nèi)含五種RecQ家族的解旋酶,其中Bloom(BLM),Werner和Rothmund-Thomson綜合癥解旋酶的缺失會(huì)分別造成Bloom[12],Werner[13]和Rothmund-Thomson綜合癥[14]三種遺傳疾病.Bloom綜合癥是一種極為罕見(jiàn)的遺傳病,它包括一系列的退行性病變?nèi)绨l(fā)育不良、智力低下、免疫能力缺失、不育以及多種罕見(jiàn)的癌癥.患者的細(xì)胞中會(huì)出現(xiàn)染色體不穩(wěn)定,包括染色體斷裂、缺失以及姐妹染色單體互換[15,16].在細(xì)胞中,BLM是一種重要的解旋酶,可以解旋多種DNA底物,包括B-DNA,holiday junction[17],D-loop[18]以及G-四聯(lián)體[19].這些結(jié)構(gòu)與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、同源重組等一系列過(guò)程相關(guān).

研究發(fā)現(xiàn),BLM甚至可以在沒(méi)有三磷酸腺苷(ATP)的存在下打開(kāi)G4[20?22],而B(niǎo)LM依賴ATP解旋G4的過(guò)程則是分步進(jìn)行的[21,23].這些研究都是采用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)技術(shù)進(jìn)行的,該技術(shù)雖然有空間分辨率高的優(yōu)勢(shì),但是由于熒光分子易于淬滅,存在觀測(cè)時(shí)間較短的問(wèn)題.本文采用高精度磁鑷技術(shù)[24]對(duì)這一問(wèn)題做了進(jìn)一步研究,分析了BLM在生理?xiàng)l件下解旋G4的過(guò)程.同時(shí),本文也采用smFRET技術(shù)研究了BLM解旋G4的過(guò)程,并與采用磁鑷研究的結(jié)果做了比較,研究了加載力在BLM解旋G4過(guò)程中的影響.通過(guò)對(duì)高濃度ATP下BLM解旋G4的研究發(fā)現(xiàn)BLM可以在解旋G4后長(zhǎng)時(shí)間停留在單鏈DNA,這為進(jìn)一步研究BLM解旋G4的機(jī)理提供了新的思路.

2 實(shí)驗(yàn)原理與方法

2.1 DNA的制備

實(shí)驗(yàn)中所用的DNA序列如表1所列,所有的DNA單鏈都由上海生工合成及純化.用于修飾熒光球的DNA片段通過(guò)氨基羧基縮合的反應(yīng)方式,在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)的催化下修飾于熒光微球(直徑200 nm,Invitrogen,F8811)的表面.磁鑷實(shí)驗(yàn)中的G4底物由G4 DNA單鏈和雙鏈DNA手柄以1:1的比例混合并退火連接而成.

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的各寡聚核苷酸序列Table 1.Sequences of oligonucleotides for the experiment.

2.2 高精度磁鑷實(shí)驗(yàn)

采用如圖1(b)所示的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),在G4序列前設(shè)計(jì)了18 nt長(zhǎng)的單鏈,以保證BLM可以有效地與G4反應(yīng).實(shí)驗(yàn)前先把聚乙二醇(PEG)修飾的蓋玻片和載玻片用雙面膠黏成密閉的小室,0.02 mg/mL鏈親和素溶于磷酸緩沖液(含20 mM磷酸鹽,pH 8.0,0.9%NaCl)沖入其中處理10 min.然后再用磷酸緩沖液沖洗,并用含10 mg/mL牛血清蛋白(BSA)的磷酸緩沖液封閉玻璃表面.先將已經(jīng)修飾好的熒光球與G4底物按摩爾比1:10混合,避光室溫放置5 min,灌入小室,再孵育10 min.用磷酸緩沖液沖走游離的熒光微球和DNA底物.磁鑷所使用的Lambda DNA(NEB公司)手柄和磁球(Invitrogen,DynabeadsrM270 Amine,預(yù)先處理成抗地高辛修飾的表面)按1:10的摩爾比混合,室溫緩慢旋轉(zhuǎn)10 min,加入含10 mg/mL BSA的磷酸緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度,注入小室,孵育30 min,磷酸緩沖液沖去游離的磁球和Lambda DNA.當(dāng)確定有單個(gè)的單分子連接后,便可加入BLM的反應(yīng)緩沖液進(jìn)行觀察.

實(shí)驗(yàn)使用的高精度磁鑷裝置是對(duì)傳統(tǒng)的磁鑷裝置進(jìn)行了改進(jìn),將磁力的測(cè)量和長(zhǎng)度的測(cè)量分開(kāi).其中磁力的測(cè)量與傳統(tǒng)的縱向磁鑷的測(cè)量方式相同,通過(guò)計(jì)算磁球布朗運(yùn)動(dòng)而得出;而距離的測(cè)量則由全內(nèi)反射場(chǎng)中的熒光球的光強(qiáng)變化計(jì)算得出[24].這一改進(jìn)減少了布朗運(yùn)動(dòng)對(duì)磁鑷的空間分辨率的影響,而且可以更精確地測(cè)量出長(zhǎng)度的相對(duì)變化.

圖1 (網(wǎng)刊彩色)(a)G4示意圖,M代表K或Na;(b)高精度磁鑷的單分子系統(tǒng)構(gòu)成圖Fig.1.(color online)(a)Schematic illustration of the structure of G4,M represents K or Na;(b)scheme of the single molecule experiment system of high resolution magnetic tweezer.

2.3 smFRET實(shí)驗(yàn)

smFRET實(shí)驗(yàn)所用蓋玻片和載玻片都先用濃硫酸和過(guò)氧化氫溶液清洗,然后在蓋玻片表面固定99%甲基化聚乙二醇(Laysan Bio,Inc.)和1%的生物素化聚乙二醇(Laysan Bio,Inc.).鏈親和素(1 mg/mL)溶于包含有50 mM NaCl,20 mM Tris-HCl,pH 7.5緩沖液中,沖入實(shí)驗(yàn)用的由PEG固定的蓋玻片制成的微流樣品池中,并孵育10 min.用上述緩沖液沖干凈后,在樣品池中加入20—50 pM濃度的DNA固定10 min.未固定于蓋玻片表面的DNA會(huì)被反應(yīng)緩沖液沖走.然后在樣品池加入含抗淬滅劑(0.8%葡萄糖(D-glucose)、1 mg/mL葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase)、0.4 mg/mL過(guò)氧化氫酶(catalase)和1 mM水溶性維生素E(Trolox))的反應(yīng)緩沖液.實(shí)驗(yàn)中所得的原始數(shù)據(jù)先進(jìn)行三點(diǎn)平滑,FRET的效率由公式IA/(ID+IA)計(jì)算得出,其中ID代表供體的光強(qiáng),IA代表受體的光強(qiáng).

3 結(jié)果與討論

3.1 G4實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件的確定

單獨(dú)的G4去折疊實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2(a)所示,當(dāng)將磁力緩慢加至G4去折疊態(tài)的位置時(shí),可以看到G4在折疊和去折疊的狀態(tài)中來(lái)回跳躍.而在有時(shí)可以看見(jiàn)G4的中間態(tài),如圖2(b)所示.圖2縱軸題l表示G4長(zhǎng)度.這證實(shí)了所用的實(shí)驗(yàn)設(shè)備可以觀察到G4的反應(yīng)細(xì)節(jié).在8 pN以下,我們從未看見(jiàn)G4的開(kāi)合.根據(jù)之前的文獻(xiàn)[7,25]報(bào)道,G4去折疊最小需要7 pN的力,因此我們的實(shí)驗(yàn)與之前的研究相符.這也確定了后面的實(shí)驗(yàn)中所使用的力不超過(guò)7 pN,實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是將磁力加載在2—3 pN保持不變.

G4是一種依靠一價(jià)陽(yáng)離子穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu),一般認(rèn)為鉀離子和鈉離子是穩(wěn)定G4的主要穩(wěn)定劑,而鉀離子穩(wěn)定效果更佳.盡管也有實(shí)驗(yàn)使用單獨(dú)的Na+作為穩(wěn)定劑,但在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),單獨(dú)的Na+穩(wěn)定效果很差.如圖3所示,在施加了2—3 pN的力以后,發(fā)現(xiàn)即使在150 mM NaCl溶液中,仍然可以看到G4不穩(wěn)定的自發(fā)開(kāi)合現(xiàn)象.而加載力相同的條件下150 mM KCl的溶液體系中,G4可以穩(wěn)定存在.因此實(shí)驗(yàn)中選擇用含150 mM KCl,50 mM NaCl,2 mM MgCl2和1 mM二硫蘇糖醇(DTT)溶于20 mM Tris-HCl,pH 7.5的緩沖液體系.在這種反應(yīng)體系中,G4以鉀離子為穩(wěn)定劑的構(gòu)型存在[26].

圖2 (網(wǎng)刊彩色)(a)G4在臨界力下折疊-去折疊臨界轉(zhuǎn)變的反應(yīng)曲線;(b)實(shí)驗(yàn)中觀察到的G4折疊-去折疊的分步狀態(tài)Fig.2.(color online)(a)The magnetic tweezer(MT)trace of G4 folding-unfolding;(b)multiple steps in G4 folding-unfolding traces.

圖3 (網(wǎng)刊彩色)(a)150 mM KCl緩沖液中的G4磁鑷反應(yīng)曲線;(b)150 mM NaCl緩沖液中的G4磁鑷反應(yīng)曲線Fig.3.(color online)(a)The MT trace with 150 mM KCl;(b)the MT traces with 150 mM NaCl.

3.2 低濃度ATP下BLM分步解旋G4

在已報(bào)道的采用smFRET研究BLM與G4的相互作用實(shí)驗(yàn)中,已確定BLM解開(kāi)G4的過(guò)程是分步的.我們將磁鑷與全內(nèi)反射熒光技術(shù)結(jié)合,得出了一致的結(jié)果.在10 nM BLM和1μM ATP的實(shí)驗(yàn)體系中同樣觀察到了G4的分步解旋,如圖4(a).圖4(a)右側(cè)顯示的狀態(tài)為穩(wěn)定的G3態(tài),這一狀態(tài)中G4的一條鏈被打開(kāi)成自由狀態(tài),可以看到,底物在G4和G3兩個(gè)亞穩(wěn)態(tài)之間來(lái)回振蕩.在可以穩(wěn)定存在的實(shí)驗(yàn)條件下,G4是不會(huì)自發(fā)打開(kāi)至G3態(tài)的.這說(shuō)明BLM在與G4結(jié)合后,會(huì)停留在G4上很長(zhǎng)時(shí)間,從而造成了這種現(xiàn)象.為了保證這種現(xiàn)象是單個(gè)BLM造成的,我們繼續(xù)降低了BLM的濃度,在BLM的濃度為2 nM時(shí)可以看到反應(yīng)終止于第100 s,如圖4(b)所示.在這一BLM濃度下,同樣可以看見(jiàn)底物在大部分時(shí)間處于G4和G3這兩個(gè)態(tài)之間.這意味著B(niǎo)LM在與G4結(jié)合后,可以停留在G4上較長(zhǎng)的時(shí)間.這一結(jié)果表明BLM與G4有較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間,而且在這段時(shí)間內(nèi)BLM并沒(méi)有離開(kāi)過(guò)G4,說(shuō)明BLM和G4有較長(zhǎng)的結(jié)合時(shí)間.

當(dāng)ATP濃度達(dá)到20μM時(shí),實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)基本無(wú)法看到中間過(guò)程,可以看到BLM在DNA上快速重復(fù)解旋.從DNA長(zhǎng)度分布上來(lái)看,這一過(guò)程中的G3態(tài)已經(jīng)不是很明顯.在本文實(shí)驗(yàn)中,同樣可以觀察到這一過(guò)程可以持續(xù)很長(zhǎng)的時(shí)間,如圖4(d)所示.

3.3 高濃度ATP下BLM解旋G4的兩種反應(yīng)現(xiàn)象

上述的BLM與G4的反應(yīng)研究中,為了觀察到反應(yīng)的細(xì)節(jié),大多都采用低濃度的ATP進(jìn)行實(shí)驗(yàn).本文實(shí)驗(yàn)中由于可以在較高的時(shí)間分辨率(50 Hz)下觀察較長(zhǎng)的時(shí)間(300 s),我們進(jìn)行了高濃度的ATP下BLM解旋G4的實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)中使用的ATP濃度為200—500μM,這一濃度已經(jīng)接近于BLM與G4反應(yīng)的飽和ATP濃度[18].為了保證可以觀察到單個(gè)BLM與G4的反應(yīng),實(shí)驗(yàn)中使用的BLM濃度為2—5 nM.實(shí)驗(yàn)中我們觀察到了兩種不同的反應(yīng)現(xiàn)象.一種是高頻率的重復(fù)解旋現(xiàn)象,如圖5(a)所示.在實(shí)驗(yàn)中,由于ATP的濃度已經(jīng)接近飽和,這種高頻率的重復(fù)解旋發(fā)生的時(shí)間很長(zhǎng),同時(shí)這種現(xiàn)象還表現(xiàn)為G4在大部分時(shí)間處于打開(kāi)的單鏈狀態(tài).這一反應(yīng)現(xiàn)象較為符合我們的預(yù)期.而另一種實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象則出乎我們的意料,觀察到了BLM在解開(kāi)G4后,G4長(zhǎng)時(shí)間處在單鏈狀態(tài).這一過(guò)程甚至可以持續(xù)到50 s以上,如圖5(b)所示.這也意味著B(niǎo)LM在解旋G4后并沒(méi)有像它在解旋雙鏈DNA一樣繼續(xù)移動(dòng).已知的BLM解旋模型都認(rèn)為ATP供能后BLM會(huì)在單鏈上移動(dòng),而我們卻發(fā)現(xiàn)了這一反?，F(xiàn)象.上述兩種現(xiàn)象以及我們?cè)诘蜐舛華TP中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都可得出一致的結(jié)論,即BLM在ATP參與下與G4的反應(yīng)過(guò)程中都表現(xiàn)出與G4很高的親和力,這也與文獻(xiàn)[20,22]的報(bào)道一致.

圖4 (網(wǎng)刊彩色)低濃度ATP下磁鑷的反應(yīng)結(jié)果 (a)10 nM BLM,1μM ATP下BLM解旋G4的曲線和伸長(zhǎng)分布;(b)2 nM BLM,1μM ATP下BLM解旋G4的曲線和伸長(zhǎng)分布;(c)2 nM BLM,20μM ATP下BLM解旋G4的曲線和伸長(zhǎng)分布;(d)5 nM BLM,20μM ATP下BLM解旋G4的曲線Fig.4.(color online)(a)The MT trace and histograms the length distribution with 10 nM BLM and 1μM ATP;(b)the MT trace and histograms of the length distribution with 2 nM BLM,1μM ATP;(c)the MT trace and histograms of the length distribution with 2 nM BLM,20μM ATP;(d)the MT traces with 5 nM BLM,20μM ATP.

與現(xiàn)階段通用的smFRET實(shí)驗(yàn)方法相比,高精度磁鑷可以在較高的空間分辨率的前提下,同時(shí)提高時(shí)間分辨率和延長(zhǎng)觀測(cè)時(shí)間.但是,與sm-FRET最重要的不同是高精度磁鑷可以在實(shí)驗(yàn)中對(duì)反應(yīng)底物施加拉力.對(duì)解旋酶而言,DNA是否受力會(huì)對(duì)解旋的模式產(chǎn)生重大影響[27].盡管在實(shí)驗(yàn)中只施加了2—3 pN的極小的拉力,但是我們認(rèn)為有必要確認(rèn)在高精度磁鑷中觀察到的結(jié)果是否是受到力的影響.我們以FRET實(shí)驗(yàn)來(lái)與磁鑷實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比.通過(guò)這種實(shí)驗(yàn)方法,可以有效地測(cè)量3—8 nm的變化[28].為了測(cè)量實(shí)驗(yàn)中G4的變化,構(gòu)建了圖6(a)所示的DNA.已知G4打開(kāi)會(huì)有21 nt的DNA伸長(zhǎng),而理論計(jì)算得出的長(zhǎng)度變化為6—8 nm,反映在熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率曲線上,這個(gè)變化大約是由0.8到0.2.在加入G4無(wú)法穩(wěn)定形成的緩沖液后,可以看到G4自發(fā)的開(kāi)合,如圖6(b)所示.

圖5 (網(wǎng)刊彩色)高濃度ATP下磁鑷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (a)3 nM BLM,500μM ATP下BLM解旋G4的曲線和伸長(zhǎng)分布;(b)2 nM BLM,500μM ATP下BLM解旋G4的曲線和伸長(zhǎng)分布Fig.5.(color online)(a)The MT trace and histograms of the length distribution with 3 nM BLM,500μM ATP;(b)the MT trace and histograms of the length distribution with 2 nM BLM,500μM ATP.

3.4 加載外力對(duì)BLM解旋G4的影響

smFRET實(shí)驗(yàn)中BLM解旋G4的反應(yīng)條件與磁鑷實(shí)驗(yàn)一致.如圖6(c)所示,在1μM的ATP下,smFRET的結(jié)果與磁鑷的結(jié)果基本一致.在smFRET實(shí)驗(yàn)中我們也觀察到了BLM分步解旋G4的過(guò)程,同時(shí)也觀察到了長(zhǎng)時(shí)間的重復(fù)解旋.如圖6(d)所示,在ATP濃度達(dá)到20μM時(shí),BLM解旋G4的過(guò)程明顯加快,重復(fù)解旋的次數(shù)也明顯增多.本文smFRET結(jié)果與前述的smFRET結(jié)果是一致的.以上的結(jié)果說(shuō)明在磁鑷實(shí)驗(yàn)中加載2—3 pN的拉力對(duì)BLM解旋并沒(méi)有造成顯著影響.

為了觀察高濃度ATP下的解旋信號(hào),我們降低了smFRET實(shí)驗(yàn)中的激發(fā)光強(qiáng),這在一定程度上降低了smFRET的空間分辨率,但卻可以延長(zhǎng)觀測(cè)時(shí)間.如圖6(e)和圖6(f)所示,在200μM ATP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,同樣觀察到了兩種不同的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象.在長(zhǎng)時(shí)間停留的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象中,由于使用了低濃度的BLM,所以在實(shí)驗(yàn)中G4處于折疊態(tài)時(shí),我們認(rèn)為BLM沒(méi)有工作.這兩種現(xiàn)象與磁鑷的結(jié)果相對(duì)應(yīng).高濃度ATP的smFRET實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證明了2—3 pN的力對(duì)BLM解旋的影響不大.同時(shí),在磁鑷中得到的反常的BLM長(zhǎng)時(shí)間停留于單鏈的現(xiàn)象也顯然不是由于磁力造成的.這種現(xiàn)象的機(jī)制值得進(jìn)一步研究.

圖6 (網(wǎng)刊彩色)(a)FRET實(shí)驗(yàn)中G4示意圖,G4與磁鑷實(shí)驗(yàn)中的G4結(jié)構(gòu)相同,cy3(綠色)和cy5(紅色)分別標(biāo)在G4鏈上和互補(bǔ)的單鏈上,G4的單鏈和互補(bǔ)鏈形成雙鏈的支架,生物素將DNA連接于有鏈親和素的玻片表面上;(b)在10 mM KCl,50 mM NaCl溶液環(huán)境中cy3和cy5的熒光光強(qiáng)的曲線(上層)和FRET曲線;(c)2 nM BLM,1μM ATP下cy3和cy5的熒光光強(qiáng)的曲線(上層)和FRET曲線;(d)2 nM BLM,20μM ATP下cy3和cy5的熒光光強(qiáng)的曲線(上層)和FRET曲線;(e),(f)2 nM BLM,200μM ATP下cy3和cy5的熒光光強(qiáng)的曲線(上層)和FRET曲線Fig.6.(color online)(a)Schematic diagram of cy3(green)-and cy5(red)-labeled DNA construct(G4)with G4 having three G-quartet planes,the G4 strand and the complementary stem strand are annealed to form a duplex stem,biotin is used to immobilize the DNA to a streptavidin-coated coverslip surface;(b)traces of fluorescence intensities of cy3 and cy5(upper panel)and FRET trace(lower panel)in 10 mM KCl and 50 mM NaCl bu ff er;(c)traces of fluorescence intensities of cy3 and cy5(upper panel)and FRET trace(lower panel)of G4 with 2 nM BLM and 1μM ATP;(d)traces of fluorescence intensities of cy3 and cy5(upper panel)and FRET trace(lower panel)of G4 with 2 nM BLM and 20μM ATP;(e),(f)traces of fluorescence intensities of cy3 and cy5(upper panel)and FRET trace(lower panel)of G4 with 2 nM BLM and 200μM ATP.

4 結(jié) 論

本文中使用高精度磁鑷方法研究了BLM解旋G4的過(guò)程.實(shí)驗(yàn)中繼smFRET實(shí)驗(yàn)之后同樣觀察到了BLM解旋G4的分步過(guò)程,同時(shí)在小力的環(huán)境下,磁鑷除了可以提高分辨率以外,還可以定性地得出反應(yīng)過(guò)程中能量的變化,其可長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)的性能也使我們可以完成接近飽和ATP濃度體系的實(shí)驗(yàn).在這種實(shí)驗(yàn)條件下觀察到了兩種反應(yīng)現(xiàn)象:一種為重復(fù)解旋,另一種為反常的解旋后解旋酶停留.可從磁鑷實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出如下結(jié)論:BLM與G4在解旋過(guò)程中有很強(qiáng)的親和力.最后我們將使用smFRET實(shí)驗(yàn)技術(shù)的結(jié)果與磁鑷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,確定了外力在BLM解旋過(guò)程中的作用.本文的結(jié)果展示了高精度磁鑷的應(yīng)用前景,它將來(lái)可以在單分子研究領(lǐng)域發(fā)揮更多的作用.

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Study of Bloom resolving G-quadruplex process by using high resolution magnetic tweezer with illumination of total internal reflection?

Zhao Zhen-Ye1)2)Xu Chun-Hua1)2)Li Jing-Hua3)Huang Xing-Yuan1)2)Ma Jian-Bing1)2)Lu Ying1)2)?

1)(Key Laboratory of Soft Matter Physics,Institute of Physics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China)
2)(School of Physical Sciences,University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China)
3)(Material and Energy School,Guangdong University of Technology,Guangdong 510006,China)

11 April 2017;revised manuscript

18 May 2017)

G-quadruplex(G4)is a DNA structure which commonly exists in human genome,and it is considered as an important structure in DNA metabolism such as replication,transcription and homologous recombination.The G-quadruplex helicases have been widely investigated these years.Of them,the Bloom(BLM)helicase is most thoroughly studied.However,there are some basic problems that are still unclear.Most of previous studies of G4 are performed by single molecule fluorescence resonance energy transfer technique.The G4 is in a free state in these experiments,which is different from the physiological environment in cells.The traditional magnetic tweezers have a limitation of spatial resolution in a low force circumstance.Thus here we use high resolution magnetic tweezer under the illumination of total internal reflection fluorescence to study the process of BLM resolving G4.Our modification of magnetic tweezer is to separate the measurements of force and distance of magnetic tweezer in order to improve the spatial resolution,which allows us to observe the unfolding process of G4.With a 2–3 pN force we find that the process of BLM unfolding G4 in low ATP concentration is stepwise,and the G4 is mainly in the state between G-quadruplex and G-triplex.We also find that the BLM could interact with G4 for a long time.Our apparatus is also able to obtain the long time observation results compared with the single molecule fluorescence technique.So we perform experiments with a nearly saturated ATP concentration.We find that the BLM has two ways to maintain G4 dissolution in this condition.The BLM could unfold the G4 repetitively in a long period and it could also keep the G4 in unfolding state for a long time after it has opened the G4.Finally,we also perform single molecule fluorescence resonance energy transfer experiment in the same condition,and we find that the 2–3 pN force in magnetic tweezers has a rare in fluence on the process of BLM interacting with G4.The results of single molecule fluorescence resonance energy transfer experiments are corresponding to the results of magnetic tweezer in the same conditions.All of our experimental results show that ATP dependent BLM has a high affinity with G4 and BLM has a different way to resolve G4 in high ATP concentration.These results could provide new ideas of the mechanism of BLM resolving G4.Our modi fied magnetic tweezer shows its capacity in G4 single molecule study,and it could be a useful tool in the future single molecule studies.

Bloom helicase,G-quadruplex,total internal reflection,magnetic tweezer

PACS:87.14.G–,87.15.H–,87.15.kjDOI:10.7498/aps.66.188701

*Project supported by the National Science Foundation of China(Grant Nos.11674382,11574381).

?Corresponding author.E-mail:yinglu@iphy.ac.cn

(2017年4月11日收到;2017年5月18日收到修改稿)

G-四聯(lián)體(G-quadruplex,G4)是廣泛存在于細(xì)胞基因組中的一種DNA結(jié)構(gòu),在DNA的代謝如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、同源重組等過(guò)程中起重要作用.G4解旋酶近年來(lái)受到廣泛研究,其中Bloom(BLM)解旋酶的研究已經(jīng)相當(dāng)豐富,但仍有一些基本問(wèn)題不清楚.我們應(yīng)用全內(nèi)反射瞬逝場(chǎng)照明磁鑷對(duì)BLM解旋G4的動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行了深入研究,觀察到了BLM解旋G4的分步過(guò)程.相對(duì)于單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)而言,借助磁鑷的長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)性能,我們?cè)诮柡腿姿嵯佘?ATP)濃度的實(shí)驗(yàn)體系中觀察到BLM長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)解開(kāi)G4或者長(zhǎng)時(shí)間維持G4于打開(kāi)狀態(tài)的兩種作用方式.最后,使用相同的實(shí)驗(yàn)條件做了單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),確定了加載2—3 pN的外力對(duì)BLM解旋G4沒(méi)有顯著影響.

10.7498/aps.66.188701

?國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào):11674382,11574381)資助的課題.

?通信作者.E-mail:yinglu@iphy.ac.cn