纖維素酶法提取黃秋葵多糖的工藝優(yōu)化

孟 楠 樊振江 高雪麗

1（漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南漯河462000）2（許昌學(xué)院，河南許昌461000）

黃秋葵（Okra,Hibiscus esculentus L.）別名羊角豆，為錦葵科秋葵屬，是一年生藥食同源植物，其果實(shí)可供食用，富含多種營(yíng)養(yǎng)素，如蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)等。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)秋葵已有研究，表明經(jīng)常食用秋葵可提高人體免疫力、增強(qiáng)體質(zhì)，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、開(kāi)發(fā)前景好的草本植物。

黃秋葵果實(shí)中富含多種營(yíng)養(yǎng)素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用保健功能極高，具有廣泛的應(yīng)用前景。有研究表明，每100 g秋葵果實(shí)中約含蛋白質(zhì)22.98 g，維生素C44 mg，磷65 mg，維生素B10.2 mg，維生素E 1.03 mg，鎂 29 mg，維生素B20.2 mg，維生素PP 1.0 mg，鐵 0.8 mg，脂肪 9.4 g，鉀 95 mg，黃酮2.56 g，鈣 45 mg。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，秋葵具有多種生物活性成分，具有很高的藥用價(jià)值。秋葵果實(shí)中特有的黏性物質(zhì)可助消化，能有效治療胃炎、保護(hù)肝臟和提高人體體質(zhì)，其黏液亦可當(dāng)做脂肪替代物使用，在巧克力和餅干制作中均有應(yīng)用。此外，秋葵多糖還具有增稠、乳化等功效。Zheng Wei等對(duì)黃秋葵花中多糖成分進(jìn)行了分離純化，結(jié)果表明水溶性多糖組分可以有效抑制癌細(xì)胞增殖，且還有一定免疫調(diào)節(jié)功能，為進(jìn)一步深入研究和應(yīng)用秋葵多糖提供了依據(jù)。因此，秋葵多糖在食品行業(yè)具有良好的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

本文以黃秋葵果實(shí)為研究對(duì)象，采用纖維素酶法提取秋葵多糖，研究反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、酶濃度、底物濃度對(duì)多糖提取率的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)黃秋葵果實(shí)多糖的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為秋葵多糖的工業(yè)化提取和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

黃秋葵，購(gòu)自河南省漯河市丹尼斯超市。

1.2 儀器

UV-2550紫外分光光度計(jì)，日本島津；DZF-6090真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋，北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，天津凱易達(dá)儀器有限公司；奧立龍pH計(jì)868型，上海熱電儀器公司；SHZ（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵和電熱套，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取工藝流程

秋葵→挑選清洗→打漿→酶法提取→減壓濃縮→真空冷凍干燥→粗多糖

1.3.2 工藝要點(diǎn)

a）原料選擇：要求秋葵新鮮，無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)霉變。

b）打漿：以一定的料水比進(jìn)行打漿，破碎秋葵，使提取更充分。

c）酶法提?。涸诓煌崛囟取⑻崛r(shí)間、酶濃度、底物濃度條件下進(jìn)行提取秋葵多糖。

d）減壓濃縮：將浸提液過(guò)濾，在真空度-0.06 MPa～0.08 MPa條件下進(jìn)行濃縮至膏狀。

e）真空冷凍干燥：真空冷凍干燥制備粗多糖。

1.3.3 秋葵多糖得率

秋葵多糖得率=提取物中多糖含量（g）/秋葵原料多糖含量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

采用苯酚-硫酸法測(cè)定秋葵多糖含量。分別配制質(zhì)量濃度為 0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL、0.07 mg/mL、0.08 mg/mL的萄萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，在490 nm處測(cè)其吸光度值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖1。回歸方程為 y=9.768 9x-0.066 7（R2=0.994 6）。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 酶解反應(yīng)的單因素試驗(yàn)

根據(jù)前期研究，本試驗(yàn)以中性纖維素酶為處理手段，分別研究提取時(shí)間、提取溫度、酶濃度、底物濃度等因素對(duì)秋葵多糖得率的影響。

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)秋葵多糖得率的影響

在固定的條件下，即底物濃度為10%(g/g)、酶濃度為0.3%(g/g)、提取溫度為50℃及pH為6.0時(shí)，提取時(shí)間分別取0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h進(jìn)行試驗(yàn)，其試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)秋葵多糖得率的影響

從圖2中可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，得率曲線(xiàn)趨于平穩(wěn)，增加不明顯。這可能是由于試驗(yàn)初始，酶濃度比較大，活性較高，能快速分解秋葵纖維組織，使秋葵多糖釋放；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶不斷被消耗，活性降低，反應(yīng)接近停滯?？紤]到經(jīng)濟(jì)實(shí)用性，確定適宜的反應(yīng)時(shí)間為2 h。

2.2.2 提取溫度對(duì)秋葵多糖得率的影響

在固定的條件下，即底物濃度為10%、酶濃度為0.3%、提取時(shí)間為1.5 h及pH為6.0時(shí)，分別選擇提取溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對(duì)秋葵多糖得率的影響

由圖3可知，在一定的作用時(shí)間里，當(dāng)提取溫度小于50℃時(shí)，秋葵多糖得率隨著反應(yīng)溫度的增加而升高；當(dāng)提取溫度超過(guò)50℃時(shí)，秋葵多糖得率隨著提取溫度的增加而降低。這是因?yàn)樵诶w維素酶酶解過(guò)程中，溫度對(duì)酶解反應(yīng)效率的影響包括兩個(gè)方面，即酶催化反應(yīng)速度及酶的穩(wěn)定性。在酶的最適溫度以下，隨著溫度的升高，反應(yīng)物的能量和分子間有效接觸的頻率增加，因而反應(yīng)速度加快；超過(guò)最適溫度，酶分子的空間結(jié)構(gòu)由于能量的增加而發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活性減弱或喪失，從而影響催化效果。由此，在溫度50℃～60℃范圍內(nèi)，秋葵多糖具有較高的得率，可作為下一步正交優(yōu)化試驗(yàn)的溫度可選范圍。

2.2.3 酶濃度對(duì)秋葵多糖得率的影響

在固定的條件下，即底物濃度為10%、提取溫度為50℃、提取時(shí)間為1.5 h及pH為6.0時(shí)，分別選擇纖維素酶酶濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%進(jìn)行試驗(yàn)，研究其對(duì)秋葵多糖得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著酶濃度的增加，秋葵多糖得率也逐漸增大。當(dāng)酶濃度超過(guò)0.4%時(shí)，秋葵多糖的得率增加不明顯，因此，確定酶的適宜濃度為0.4%。

2.2.4 底物濃度秋葵多糖得率的影響

在固定的條件下，即酶濃度為0.3%、提取溫度為50℃、提取時(shí)間為1.5 h及pH為6.0時(shí)，分別選擇底物濃度為5%、10%、15%、20%、25%進(jìn)行試驗(yàn)，研究其對(duì)秋葵多糖得率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖4 酶濃度對(duì)秋葵多糖得率的影響

圖5 底物濃度對(duì)秋葵多糖得率的影響

由圖5可以看出，隨著底物濃度的增加，秋葵多糖得率都逐漸增大，主要是因?yàn)榈孜餄舛仍黾?，反?yīng)速率增加。但當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)達(dá)到一定值時(shí)，反應(yīng)速率顯著減小。

2.3 酶解反應(yīng)的優(yōu)化試驗(yàn)

由單因素試驗(yàn)可以得出酶解反應(yīng)適宜作用條件：底物濃度為10%、酶濃度為0.4%、提取時(shí)間為1.5 h、提取溫度為50℃及pH為6.0。為進(jìn)一步得到酶解的較優(yōu)條件，再進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下頁(yè)表2。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表

由極差分析可知，各因素對(duì)秋葵多糖得率的影響大小順序?yàn)椋篈＞C＞D＞B，即酶濃度＞底物濃度＞提取時(shí)間＞提取溫度，最優(yōu)組合為A4B4C3D3，即酶濃度為0.5%，提取時(shí)間為2.0 h，提取溫度為60℃，底物濃度為10%。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表3方差分析結(jié)果可知，在顯著水平P=0.05時(shí)，酶濃度、底物濃度兩因素都顯著，由方差分析得出影響因素大小順序?yàn)槊笣舛?、底物濃度、提取時(shí)間、提取溫度，這和極差分析結(jié)果一致。

經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，正交優(yōu)化出的條件為：酶濃度0.5%，提取時(shí)間2.0 h，提取溫度60℃，底物濃度10%，此工藝條件下秋葵多糖得率為81.06%。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，影響秋葵多糖得率的4個(gè)因素的主次順序?yàn)椋好笣舛龋镜孜餄舛龋咎崛r(shí)間＞提取溫度，最優(yōu)組合為A4B4C3D3，即酶濃度為0.5%，提取時(shí)間為2.0 h，提取溫度為60℃，底物濃度為10%。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得在最佳條件下秋葵多糖得率為81.06%。采用纖維素酶法提取秋葵多糖，具有高效、易操作，對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)勢(shì)。

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