超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黃豆中丙硫菌唑和甲氧咪草煙

陳倩娟

（譜尼測(cè)試（天津）科技有限公司，天津 300000）

丙硫菌唑是一種新型三唑硫酮類殺菌劑，主要用于防治由子囊菌、擔(dān)子菌以及半知菌引起的病害。近年來(lái)，丙硫菌唑在谷物、油菜籽和花生等農(nóng)產(chǎn)品中廣泛應(yīng)用。隨著丙硫菌唑的使用和推廣，國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）、美國(guó)、歐盟、日本均規(guī)定了其在糧谷等作物中的限量。2017年6月18日實(shí)施的GB 2763—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定丙硫菌唑在大豆中最高殘留限量為1 mg/kg。甲氧咪草煙屬咪唑啉酮類高效除草劑，主要用于大豆田及花生田苗后除草，可有效除去大多數(shù)一年生禾本科雜草及闊葉雜草。GB 2763—2016規(guī)定甲氧咪草煙在大豆中最高殘留限量為0.1 mg/kg。目前關(guān)于丙硫菌唑和甲氧咪草煙還沒(méi)有統(tǒng)一的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，本文建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）同時(shí)檢測(cè)黃豆中丙硫菌唑及甲氧咪草煙的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters TQD），配有電噴霧離子源；電子天平，感量0.1mg；均質(zhì)器；高速離心機(jī)；水浴超聲提取器；XW-80A渦旋器；TG18-WS臺(tái)式離心機(jī)。

丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)品(CAS：178928-70-6)；甲氧咪草煙標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：178928-70-6）；乙腈、甲醇，均勻色譜純；氯化鈉、甲酸，均為優(yōu)級(jí)純；0.1%二甘醇（DEG）；水，符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 樣品處理

取20 g粉碎后的黃豆試樣，按1:1比例加水，加入60 mL乙腈，9 500 r/min均質(zhì)2 min，抽濾后將濾液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，分液漏斗內(nèi)加入7 g氯化鈉和10 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖鹽溶液，充分混合后放置10 min，將下層水放出。將鹽析后的提取液加入0.1%DEG于40℃旋蒸濃縮至近干，用20%甲醇/丙酮定容至10 mL，用Envi-Carb/DSC-SAX柱凈化，凈化液加入1 mL 0.1%的DEG，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，2 mL甲醇定容，LC-MS/MS測(cè)定。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

Waters BEH-C18柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）；流動(dòng)相：A液為乙腈，B液為0.1%甲酸溶液，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1；柱溫：40℃;進(jìn)樣量：10 μL，流速：0.2 mL/min。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件

ESI源；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣及錐孔氣：N2；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；碰撞氣：高純氬氣；保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)、錐孔電壓及碰撞能量見(jiàn)表2。

表2 甲氧咪草煙和苯硫菌唑質(zhì)譜采集參數(shù)

1.4 定性測(cè)定

試樣中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間相比較，變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。待測(cè)化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括1個(gè)母離子和2個(gè)子離子，且樣品中目標(biāo)化合物的2個(gè)子離子的相對(duì)豐度比應(yīng)符合表3。

表3 定性時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

2 結(jié)果與分析

2.1 母離子和子離子的選擇

采用針泵流動(dòng)注射進(jìn)樣，離子源為電噴霧電離源（ESI源），在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下對(duì)甲氧咪草煙及丙硫菌唑的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，錐孔電壓及碰撞能量的優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。甲氧咪草煙在進(jìn)入一級(jí)質(zhì)譜后，在正離子掃描模式下，產(chǎn)生穩(wěn)定的［M]+分子離子峰，即質(zhì)荷比（m/z）為 306.14，［M]+離子作為甲氧咪草煙的母離子產(chǎn)生有顯著豐度的m/z為69.07及86.12碎片離子。丙硫菌唑在負(fù)離子掃描模式下，產(chǎn)生穩(wěn)定的［M－H]-準(zhǔn)分子離子峰，即m/z為342.04；丙硫菌唑在碎片離子掃描方式下，以［M－H]-負(fù)離子作為丙硫菌唑的母離子，產(chǎn)生m/z為99.91、125.034、264.2等碎片離子。甲氧咪草煙和丙硫菌唑多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖分別見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 甲氧咪草煙多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖

圖2 丙硫菌唑多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖

圖3 甲氧咪草煙和丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取條件的選擇

甲氧咪草煙和丙硫菌唑都易溶于乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)試劑，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙腈提取后峰形及回收率均較好，因此在提取過(guò)程中使用乙腈作為提取液，再采用氯化鈉鹽析除蛋白，用Envi-Carb/DSC-SAX柱凈化，將流動(dòng)相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定采用梯度洗脫方式可有效分離待測(cè)物，洗脫程序見(jiàn)上頁(yè)表1。在此條件下測(cè)得的待測(cè)物的峰形對(duì)稱，基線平穩(wěn)，并且分析時(shí)間較短。

2.3 分析方法的線性范圍

將甲氧咪草煙和丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，進(jìn)樣液質(zhì)量濃度分別為20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L，分別以甲氧咪草煙和丙硫菌唑質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得甲氧咪草煙的線性方程為y=1 129x-1 521，相關(guān)系數(shù)為0.999 9；丙硫菌唑的線性方程為y=3.09 9x-12.30，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。甲氧咪草煙和丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3，線性相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 甲氧咪草煙和丙硫菌唑的線性相關(guān)結(jié)果

2.4 定量限

以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時(shí)，取信噪比S/N=10和樣品處理過(guò)程的稀釋倍數(shù)計(jì)算得出定量限（LOQ）。稱樣量為20 g，最后定容體積為2 mL時(shí)所對(duì)應(yīng)的定量限分別為0.1 mg/kg、1.0 mg/kg。

2.5 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

在陰性黃豆樣品中添加2個(gè)濃度水平的甲氧咪草煙和丙硫菌唑標(biāo)準(zhǔn)液，按上述前處理方法進(jìn)行處理，做回收試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)6次，精密度結(jié)果見(jiàn)第49頁(yè)表5。甲氧咪草煙和丙硫菌唑在黃豆中添加回收率在77.3%～84.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于1.0%。

3 結(jié)論

本方法可對(duì)黃豆中甲氧咪草煙和丙硫菌唑殘留量在定性測(cè)定的同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法前處理操作簡(jiǎn)便、精密度和準(zhǔn)確度較高，分析時(shí)間短、線性關(guān)系良好，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確及分離效果好的優(yōu)點(diǎn)。

表5 黃豆中甲氧咪草煙和丙硫菌唑殘留量回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

［1］白雪，周成合，米佳麗.三唑類化合物研究與應(yīng)用［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2007，19（7）：721-729.

［3］劉長(zhǎng)令.世界農(nóng)藥大全:殺菌劑卷［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006.