Wnt信號通路對骨髓間充質(zhì)干細胞CXCR4表達的調(diào)控作用

孫吉平 馬瑩 張文靜 呂佳 尹愛萍

·實驗研究·

Wnt信號通路對骨髓間充質(zhì)干細胞CXCR4表達的調(diào)控作用

孫吉平 馬瑩 張文靜 呂佳 尹愛萍

目的研究經(jīng)典Wnt信號通路對骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)CXCR4表達的影響，探索Wnt通路調(diào)節(jié)干細胞遷移的可能機制。方法培養(yǎng)雄性SD大鼠BMSCs，對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定；通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)探討活化/阻斷Wnt信號通路對BMSCs表達CXCR4的影響。結(jié)果①BMSCs的體外培養(yǎng)及鑒定：細胞呈梭形，漩渦狀排列，放射狀生長。細胞表面標志CD29(+)、CD90(+)、CD45(-)，能定向誘導細胞表達神經(jīng)細胞標記物，體外能分化為脂肪細胞，符合BMSCs表面標記物表達及多向分化潛能特征。②應用200 ng/ml的Wnt3a作用24 h即可以充分激活經(jīng)典Wnt信號通路，應用100 ng/ml的DKK-1作用24 h可以充分阻斷經(jīng)典Wnt信號通路。③阻斷經(jīng)典Wnt信號通路可以促進體外培養(yǎng)的BMSCs的CXCR4的表達；激活經(jīng)典Wnt信號通路可以抑制體外培養(yǎng)的BMSCs的CXCR4的表達。結(jié)論干預Wnt信號通路可以調(diào)控BMSCs CXCR4表達，經(jīng)典Wnt信號通路有望通過CXCR4/SDF-1通路調(diào)控BMSCs向組織的遷移。

骨髓間充質(zhì)干細胞；經(jīng)典Wnt信號通路；β-catenin；CXCR4

干細胞工程的興起為多種疾病的治療帶來了希望。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)易于獲取，具有高分化潛能，可以實現(xiàn)自體移植，具有低免疫原性，不會誘發(fā)移植后排斥反應，不涉及倫理問題，作為組織工程的種子細胞，具有相當明朗的應用前景[1]。BMSCs可以通過靜脈/動脈/器官移植等方式移植入體內(nèi)；然而，無論靜脈、動脈或者多次器官內(nèi)移植，均面臨BMSCs移植后靶向遷移數(shù)量少這一缺點[2-3]。因此，提高BMSCs靶向遷移能力對于提高BMSCs在疾病治療中的應用至關重要。經(jīng)典Wnt信號通路即Wnt/GSK-3/β-catenin信號通路，是胚胎發(fā)育、組織形成過程中決定細胞命運的關鍵性信號通路。已經(jīng)證實，經(jīng)典Wnt信號通路參與調(diào)控BMSCs細胞外基質(zhì)的遷移過程[4]，然而其確切的機制與效應尚存在爭議。BMSCs表面表達多種黏附分子及整合素，其中許多分子都被認為與細胞遷移有關。CXC趨化因子受體4(CXC chemokine Receptor 4，CXCR4)選擇性地與基質(zhì)細胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1, SDF-1)結(jié)合，已經(jīng)被證明在腫瘤發(fā)生、增生、代謝、血管生成中、細胞遷移中發(fā)揮重要作用[5]。通過上調(diào)干細胞表面CXCR4表達促進干細胞的靶向歸巢作用，從而促進干細胞發(fā)揮治療作用，改善干細胞移植后的治療效果，是近些年醫(yī)學研究的熱點之一。本研究旨在探索經(jīng)典Wnt信號通路狀態(tài)與BMSCs表面CXCR4表達量的關系，探索經(jīng)典Wnt通路調(diào)節(jié)BMSCs遷移的可能機制。

材料與方法

一、實驗動物

選擇成年近交封閉群SD大鼠(清潔級，3～4周齡、80～100 g)，由西安交通大學醫(yī)學院動物中心提供使用。

二、試劑

DMEM(一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，Dulbecco’s MEM)、Trypsin胎牛血清、青霉素、鏈霉素均購自GIBCO公司；DAPT[(3,5-二氟苯乙?；?-L-丙氨?；?L-2-苯基甘氨酸叔丁酯]、DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)、尼克酰胺、瓊脂糖均購自Sigma公司；EGF(表皮生長因子)、bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)、激活素a均購自peprotech公司；小鼠抗大鼠胰島血糖素抗體、兔大鼠抗ngn3抗體購自Santa Crμz公司；小鼠抗大鼠胰島素抗體購自CST公司；GAPDH抗體購自Proteintech；Trizol購自Invitrogen 公司；β-巰基乙醇購自Amresco公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自大連寶生物公司；IGF-1購自武漢禾元生物科技有限公司。熒光標記二抗購自北京中杉金橋公司。

三、大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)和擴增

SD大鼠經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉后，75%酒精浸泡5～10 min，無菌條件下逐層剪開皮膚、肌肉，取其雙側(cè)股骨、脛骨，超凈臺內(nèi)用5 ml注射器抽取含10% FBS(胎牛血清)培養(yǎng)基沖出骨髓，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10% FBS的L-DMEM培養(yǎng)液，充分吹打成單細胞懸液，按1×106密度接種于2個25 cm2培養(yǎng)瓶中于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，3 d后首次半量換液，后每3 d換液。待細胞長至80%～90%融合時傳代。每瓶細胞加1 ml的0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA(乙二胺四乙酸)，置孵箱消化2～3 min，各加入2 ml含10%FBS培養(yǎng)基終止消化，吹打成單細胞懸液，轉(zhuǎn)移入離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基重懸浮沉淀，按1∶2比例傳代。

四、BMSCs鑒定

(1)流式細胞儀檢測細胞CD45、CD90、CD29等表面抗原表達：對數(shù)生長期細胞常規(guī)消化、離心后，PBS洗滌3次后，PBS重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整濃度為1×107/ml，混勻后各取100 μl細胞懸液至4個1.5 ml EP管中，分別加入0.5 μl FITC(anti-rat CD45)抗體、2 μl anti-rat CD29抗體、1 μl PE anti-rat CD90抗體，同時設立同型陰性對照，避光冰上孵育30 min；PBS調(diào)至 500 μl；輕柔振蕩，重懸細胞，流式細胞儀檢測。

(2)體外誘導分化為神經(jīng)細胞：參考Sanchez-Ramos等的方法進行。BMSCs去除培養(yǎng)基，D-Hank’s液清洗3次，換為Neurobasel培養(yǎng)基(添加5%馬血清，1%標準胎牛血清，2%ITS，0.5 μM維甲酸，10 ng/ml BDNF)培養(yǎng)6 d，間接免疫熒光染色檢測神經(jīng)細胞相關標記物NSE、GFAP、NF-200等的表達。

(3)誘導BM-MSC成脂肪分化：P3的細胞制成單細胞懸液后，成脂誘導培養(yǎng)基(10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，含有4 mmol/L L-谷氨酰胺、10 μg/ml胰島素、0.25 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBXM、50 μmol/L吲哚美辛及1ml/L青霉素和鏈霉素混懸液等)重懸并計數(shù)，以5×104/ml孔細胞密度接種6孔板，十字形晃動6孔板，使細胞分散均勻，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每3 d全量換液，持續(xù)15 d誘導培養(yǎng)，PBS洗滌后-20℃凍存20 min；4%多聚甲醛固定后PBS洗滌，加油紅O稀釋液1.5 ml，室溫靜置30 min；PBS洗滌后蘇木素復染5 min，倒置顯微鏡觀察。

五、干預BMSCs經(jīng)典Wnt信號通路

選用同一批處于對數(shù)增長期第3代細胞，待細胞長至60%～70%融合時即可分組進行干預。將細胞隨機分為Wnt3a組(W組)、DKK-1組(D組)、對照組(C組)。棄去細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基。用PBS液洗2～3遍后，在W組、D組細胞中按目標濃度加入相應體積的Wnt3a、DKK-1(表1)，最終使得培養(yǎng)基中分別含有200 ng/ml的Wnt3a，100 ng/ml的DKK-1，對BMSCs的經(jīng)典Wnt信號通路進行干預。24 h后終止干預。隨后Real Time PCR及Western-blotting研究Wnt信號通路下游mRNA和蛋白的表達。

表1 各干預組培養(yǎng)液配制方法

注：每個25 cm2培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)基的總體積為3 000 μl

六、Real Time PCR法檢測Wnt信號通路下游β-catenin mRNA轉(zhuǎn)錄水平

將消化脫落的貼壁BMSCs離心收集，取100 μl細胞懸液放入1.5 ml EP管中；加入標有RA2的液體500 μl，充分混勻，顛倒5～10次，靜置1 min；將裂解后的混懸液全部吸入已經(jīng)插在外套管里的內(nèi)套管中，15 000 rpm離心1 min；取出各個內(nèi)套管，先吸去外套管中液體，再將其放入內(nèi)套管中，加入500 μl洗液，15 000 rpm離心1 min；將內(nèi)套管取出，移入備好的1.5 ml的EP管中，在內(nèi)套管的膜的正中部位加入洗液28 μl；室溫靜置1 min后，15 000 rpm離心1 min，獲得總RNA；采用SYBR Green分析法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應用Thermal Cycler Dice Real Time System II擴增儀進行Real Time PCR反應，采用兩步法PCR擴增標準程序(圖1)，所有操作均在冰上進行。

注：Stage1：預變性，95℃，30s；Repeat：1；Stage2：PCR反應，95℃，5s；60℃，30s；Repeat：40圖1 兩步法PCR擴增標準程序

七、激活/阻斷經(jīng)典Wnt信號通路對于CXCR4/SDF-1的影響

通過RT-PCR法檢測CXCR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。提取RNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA、實時熒光定量PCR方法與步驟同前，加入CXCR4的上下游引物。

以上RT-PCR反應所使用的引物序列見表2。以β-actin為內(nèi)參照基因，分析各組細胞目的基因的相對表達量。

表2 RT-PCR反應引物序列

八、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素分析，包括方差分析、t檢驗，兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、BMSC培養(yǎng)及鑒定

流式細胞儀檢測顯示：第4代BMSCs表達干細胞表面特異性標志物CD29、CD90，而不表達CD45(造血細胞標記)，說明其同源性，符合BMSCs免疫表型特征(圖2)。為證明其多向分化潛能，本文研究了BMSCs體外向神經(jīng)細胞、脂肪細胞的分化潛能。BMSCs誘導后能表達神經(jīng)細胞標記物Nestin蛋白、NSE及神經(jīng)膠質(zhì)細胞標記物GFAP，證實BMSCs體外可向神經(jīng)細胞分化。此外，BMSCs經(jīng)成脂誘導2周后進行油紅O染色，可見細胞內(nèi)出現(xiàn)圓形的紅色顆粒，大小不等，證明胞漿中的顆粒確實為脂肪滴。(圖3～4)

圖2 第4代BMSC表面標志物表達情況：CD29陽性，陽性率為99．96%；CD90陽性，陽性率為99．99%；CD45陰性，陰性率為1．45%

A：NSE染色(Cy3，×300)；B：GFAP染色(Cy3，×300)；C：誘導24hNestin染色結(jié)果(Cy3，×150)；D：誘導6dNF200染色結(jié)果(Cy3，×150)圖3 BMSCs誘導后神經(jīng)細胞標記物表達

圖4 BMSCs成脂誘導2周后油紅O染色(×400)

二、Wnt3a/DKK-1對經(jīng)典Wnt信號通路狀態(tài)影響

BMSCs經(jīng)200 ng/ml的Wnt3a(W組)、100 ng/ml的DKK-1(D組)處理24 h后，提取RNA行Real Time PCR檢測經(jīng)典Wnt信號通路下游分子β-catenin的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果見表3。與對照組(C組)相比，W組β-catenin的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，D組β-catenin的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5)，提示W(wǎng)nt3a/DKK-1可以激活/阻斷經(jīng)典Wnt信號通路。

表3 Wnt3a/DKK-1處理后Real-Time PCR檢測結(jié)果

注：與對照組比較，aP<0.05

注：與C組比較，aP<0．05圖5 細胞經(jīng)Wnt3a、DKK?1處理24h后β?catenin的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

三、經(jīng)典Wnt信號通路對BMSCs的CXCR4表達的影響

C組、W組、D組骨髓間充質(zhì)干細胞CXCR4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果見表4。D組CXCR4的表達量升高，與C組相比，差異有統(tǒng)計學意義(圖6，P<0.05)；W組CXCR4的表達量有所下降，但與C組相比，差異無統(tǒng)計學意義，提示當經(jīng)典Wnt信號通路被激活時，BMSCs表面CXCR4的表達量下調(diào)；當經(jīng)典Wnt信號通路被阻斷時，BMSCs表面CXCR4的表達量上調(diào)。

表4 Wnt3a/DKK-1處理后BMSCs的CXCR4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平

注：與C組比較，aP<0.05

注：與C組比較，aP<0．05圖6 經(jīng)Wnt3a/DKK?1處理后CXCR4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平

討 論

干細胞治療蒸蒸日上，正以轉(zhuǎn)化醫(yī)學這一新角度新途徑，從基礎醫(yī)學研究走向臨床及公共衛(wèi)生防治，并已經(jīng)取得顯著進展。已經(jīng)證實BMSCs可用于多種疾病的細胞治療，如移植可以減少蛋白尿、減少腎小球損傷、分化為腎臟固有細胞，并調(diào)節(jié)免疫反應[6-8]；移植后能夠促進內(nèi)源性胰島細胞增殖、胰島干細胞的分化，促進胰島再生[9]；分化為神經(jīng)細胞，移植后能改善阿爾茨海默病等[10]。然而，無論靜脈、動脈或者多次器官內(nèi)移植，均面臨BMSCs移植后靶向遷移數(shù)量少這一缺點，導致了BMSCs向損傷組織的歸巢的不充分性[11]，而間充質(zhì)干細胞向受損組織充分的遷移對于療效而言非常重要。因此，提高BMSCs靶向遷移能力對于提高BMSCs在糖尿病腎病中的治療具有至關重要的作用。多種分子機制參與調(diào)節(jié)細胞在循環(huán)系統(tǒng)中的遷移。已經(jīng)證明，BMSCs表面表達多種黏附分子及整合素，其中許多都被認為與細胞遷移有關。細胞因子及其受體是免疫監(jiān)督、炎癥、發(fā)育過程中調(diào)節(jié)細胞遷移的關鍵介質(zhì)。CXCR4選擇性地與SDF-1結(jié)合，已經(jīng)被證明在腫瘤發(fā)生、增生、代謝、血管生成、細胞遷移中發(fā)揮重要作用。已經(jīng)有報道BMSCs表面表達CXCR4，在BMSCs體外擴增的過程中，其CXCR4的表達量顯著降低，導致了其向SDF-1的遷移量減少，推測可能由于BMSCs表面表達CXCR4減少導致了BMSCs遷移效率的下降[12-13]。經(jīng)典Wnt信號通路即Wnt/GSK-3/β-catenin信號通路，是胚胎發(fā)育、組織形成過程中，決定細胞命運的關鍵性信號通路，它能夠編碼、分泌多種細胞因子，影響胚胎及組織發(fā)育過程中細胞的增殖、極化、分化、老化、凋亡，對腎臟、腎小球的發(fā)育有至關重要的作用，經(jīng)典Wnt信號通路參與調(diào)控胰腺發(fā)育，調(diào)控胰島β細胞的增殖及胰島素功能的發(fā)揮，其突變或異?？梢l(fā)包括纖維化、糖尿病腎病等在內(nèi)的多種腎臟病變[14-15]。研究證實，體外應用Wnt配體可以實現(xiàn)對經(jīng)典Wnt信號通路的激活，應用DKK家族可以抑制經(jīng)典Wnt信號通路。本研究應用200 ng/ml的Wnt3a實現(xiàn)了對于經(jīng)典Wnt信號通路的激活，應用100 ng/ml的DKK-1實現(xiàn)了對于經(jīng)典Wnt信號通路的阻斷，阻斷效果可靠。通過上調(diào)干細胞表面CXCR4表達量促進干細胞的靶向歸巢作用，從而促進干細胞發(fā)揮治療作用，改善干細胞移植后的治療效果，是近些年醫(yī)學研究的熱點之一。經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)節(jié)干細胞的轉(zhuǎn)化、分化等多種屬性，而且已經(jīng)證實經(jīng)典Wnt信號通路參與調(diào)控BMSCs向細胞外基質(zhì)的遷移，然而其確切的機制與效應尚存在爭議。本研究結(jié)果表明，應用100 ng/ml的DKK-1阻斷經(jīng)典Wnt信號通路可以提高體外培養(yǎng)的BMSCs的CXCR4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；相反，應用200 ng/ml的Wnt3a激活經(jīng)典Wnt信號通路可以抑制體外培養(yǎng)的BMSCs的CXCR4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白翻譯水平。因為CXCR4/SDF-1參與調(diào)控腫瘤細胞及干細胞的遷移[16-17]。因此，我們推測，經(jīng)典Wnt信號通路有望通過CXCR4/SDF-1調(diào)控BMSCs移植后的歸巢；阻斷經(jīng)典Wnt信號通路后促進干細胞的靶向遷移可能是干細胞移植發(fā)揮治療作用的機制之一。

促進干細胞向受損部位的遷移，增加遷移的細胞數(shù)量，提升移植后治療效果，這是提升干細胞治療效果的一個新機制。然而，本研究只觀察到經(jīng)典Wnt信號通路狀態(tài)改變與CXCR4/SDF-1表達量變化的對應關系，并未進行體外細胞、體內(nèi)動物實驗進一步驗證，也未進一步探索產(chǎn)生這種變化的具體機制，故后續(xù)可以繼續(xù)進行細胞遷移小室實驗，探索當BMSCs胞內(nèi)經(jīng)典Wnt信號通路狀態(tài)不同、引起CXCR4表達量改變時，BMSCs向SDF-1的趨化改變；干預經(jīng)典Wnt信號通路后的BMSCs移植入糖尿病腎病大鼠體內(nèi)后，觀察體內(nèi)示蹤的時間，驗證經(jīng)典Wnt信號通路狀態(tài)改變時對于移植的BMSCs靶向遷移、移植效果的影響。目前調(diào)控干細胞遷移的分子機制尚未明確，相關的信號通路也有待進一步研究探索，作為與干細胞遷移機制的新成員，無論CXCR4/SDF-1抑或經(jīng)典Wnt信號通路，都將會促進間充質(zhì)干細胞移植治療的研究進展，改善干細胞移植后的治療效果。

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TheeffectsofcanonicalWntsignalingpathwaysontheCXCR4expressionofbonemarrowderivedmesenchymalstemcells

SUNJi-ping,MAYing,ZHANGWen-jing,LVJia,YINAi-ping.

DepartmentofNephrology,TheFirstAffiliatedHospitalofMedicalCollege,Xi'anJiaotongUniversity,Xi'an710061,China

YINAi-ping,E-mail：jipingsundwy@126.com

ObjectiveTo evaluate the effects of Wnt signaling pathways on the CXCR4 expression of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs), and to investigate the possible regulation mechanisms of the Wnt signaling pathways on the migration ability of BMSCs.MethodsBMSCs were obtained from the femurs, tibias, humeri and radius of adult male SD rats. The expression of Wnt signaling pathway downstream target gene β-catenin was detected via RT-PCR and western-blotting after activating and blocking Wnt signaling pathway of BMSs. Meanwhile, expression of CXCR4 was also detected via RT-PCR and western-blotting after activating and blocking Wnt signaling pathway of BMSCs.Results(1)Dentification of BMSCs: BMSCs could expression CD29 and CD90, which were both marker of mesenchymal stem cells. Besides, BMSCs could express nerve culluar marker such as NSE, GFAP, and could be induced to differentiate into adipocytic cells, suggesting multi-directional differentiation.(2)Wnt3a (200 ng/ml) could fully activate Wnt signaling pathway in 24 h, with high expression level of β-catenin(compared with control group,P<0.05). While DKK-1 (100 ng/ml) could fully blockade Wnt signaling pathway in 24 h (compared with control group,P<0.05). (3)When the Wnt signaling pathway was blockaded, expression levels of CXCR4 in BMSCs was obviously increased (compared with control group,P<0.05); while the activated of such signaling pathway could decrease the expression of CXCR4 of BMSCs (compared with control group,P<0.05).ConclusionsWnt signaling pathway could regulate the expression of CXCR4 of BMSCs, and such regulation may promote the migration of BMSCs to kidney.

Bone Mesenchymal stem cells; Canonical Wnt signaling pathway; β-catenin; CXCR4

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.12.010

國家自然科學基金資助項目(No.81200528)

710061 西安，西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科

尹愛萍，E-mail：jipingsundwy@126.com

2017-12-04

2017-12-07)