食品中綠豆成分PCR特異性檢測(cè)方法的建立

趙仲麟，李瑞歌，秦志揚(yáng)，王 成，王 永,袁 超, 蘭青闊

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 河南 鄭州 450002； 2. 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津 300381)

食品中綠豆成分PCR特異性檢測(cè)方法的建立

趙仲麟1，李瑞歌1，秦志揚(yáng)1，王 成2，王 永2,袁 超1, 蘭青闊2

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 河南 鄭州 450002； 2. 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津 300381)

針對(duì)綠豆物種特異性序列，設(shè)計(jì)了定性PCR引物，建立了綠豆源性成分檢測(cè)方法,并對(duì)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol·L-1的引物濃度,52、54、56、58、60、62 ℃的退火溫度等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)該方法的靈敏度、特異性和檢出限進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果表明,在引物濃度0.4 μmol·L-1、退火溫度58 ℃條件下的擴(kuò)增效果最優(yōu)，綠豆的檢出限可達(dá)到0.5 %。該檢測(cè)方法具有高度的特異性，操作方便、簡(jiǎn)單、快捷，可為食品安全的檢測(cè)提供依據(jù)。

食品; 綠豆成分；凝膠電泳；PCR；特異性檢測(cè)

目前，食品摻假問(wèn)題是中國(guó)食品質(zhì)量管理面臨的重大挑戰(zhàn)之一[1]。假冒偽劣食品嚴(yán)重威脅人們的身體健康。人們?cè)趽?dān)憂污染物對(duì)健康造成威脅的同時(shí)，食品摻假問(wèn)題同樣引起人們的重視。以綠豆食品為例，一些企業(yè)為獲取高額利潤(rùn)，常利用豌豆、大豆等其他原材料充當(dāng)綠豆食品出售，違反了消費(fèi)者的合法權(quán)益[2]。中國(guó)政府也已加大對(duì)食品行業(yè)的監(jiān)管力度，同時(shí)制定更嚴(yán)苛的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，以期重拾消費(fèi)者對(duì)政府和企業(yè)的信心。食品成分檢測(cè)的方法主要有：(1)依靠形態(tài)學(xué)鑒別手段的傳統(tǒng)感官或物理方法鑒別，如電子舌和電子鼻技術(shù)的應(yīng)用[3-4]；(2)基于儀器的檢測(cè)方法，如核磁共振波譜技術(shù)[5]、近紅外光譜技術(shù)[6]、液質(zhì)聯(lián)用[7]等方法；(3)蛋白質(zhì)大分子檢測(cè)方法，如利用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)食品中花生過(guò)敏原蛋白成分[8]；(4)DNA分子檢測(cè)方法，常用有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[9]、指紋圖譜技術(shù)[10]及基因芯片技術(shù)[11]。PCR方法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高等特點(diǎn)，已經(jīng)普遍用于農(nóng)產(chǎn)品、食品的檢測(cè)分析中。目前，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有針對(duì)綠豆制品的檢測(cè)分析標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用的特異性PCR檢測(cè)手段，對(duì)食品中的綠豆成分進(jìn)行檢測(cè)，以期為綠豆成分檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 引物設(shè)計(jì)及篩選

收集、分析和驗(yàn)證綠豆mgQ062FRFLP序列，獲得綠豆物種特異性序列。根據(jù)該特異性序列，設(shè)計(jì)定性PCR引物；在通用的PCR擴(kuò)增程序和反應(yīng)體系條件下，比較不同引物擴(kuò)增條帶的特異性、亮度等，選擇表現(xiàn)相對(duì)好的引物對(duì)作為候選引物對(duì)。

1.2 PCR反應(yīng)退火溫度和引物濃度優(yōu)化

本試驗(yàn)設(shè)置引物濃度優(yōu)化范圍為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol·L-1，退火溫度優(yōu)化范圍 52、54、56、58、60、62 ℃，根據(jù)擴(kuò)增條帶的亮度、引物二聚體等表現(xiàn)，確定合適的引物濃度和擴(kuò)增退火溫度。DNA模板為50 mg·L-1(10%綠豆，基質(zhì)為小麥粉)，本試驗(yàn)使用Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2購(gòu)自Promega公司的，引物由金唯智公司合成。

1.3 綠豆檢測(cè)方法特異性和檢出限測(cè)試

選用不同豆類作物及常見(jiàn)的農(nóng)作物共28種進(jìn)行特異性測(cè)試，驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)是僅在綠豆中獲得預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物。28種測(cè)試樣品為：(1)空白對(duì)照：水；(2)綠豆；(3)豌豆；(4)紅豆；(5)黃豆；(6)蠶豆；(7)長(zhǎng)奶花豆；(8)花豆；(9)菜豆；(10)熊貓豆；(11)雀蛋豆；(12)大花黑蕓豆；(13)小白豆；(14)紫羅蘭豆；(15)大白豆；(16)竹花豆；(17)長(zhǎng)熊豆；(18)扁豆；(19)青豆；(20)黑豆；(21)大黑豆；(22)豇豆；(23)玉米；(24)水稻；(25)小麥；(26)白芝麻；(27)黑芝麻；(28)花生。

檢出限LOD一般是指不低于95%的檢出情況下的綠豆含量，嚴(yán)格的測(cè)試試驗(yàn)是在60次平行試驗(yàn)中至少檢出59次陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

檢索、搜集到文獻(xiàn)中提供的綠豆普通PCR定性檢測(cè)方法[12]，經(jīng)分析和驗(yàn)證獲得綠豆物種特異性序列mgQ062FRFLP。根據(jù)該特異性序列信息，應(yīng)用primer 3.0在線軟件(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)綠豆源性成分定性PCR引物。PCR引物序列信息詳見(jiàn)表1，預(yù)期目的片段長(zhǎng)度為470 bp和425 bp。

表 1 綠豆源性成分特異性引物序列信息Table 1 Specific primer sequences for mung bean

使用CTAB法提取綠豆等基因組DNA[12]，應(yīng)用通用的PCR反應(yīng)條件(DNA模板50 ng)，對(duì)2對(duì)引物進(jìn)行特異性測(cè)試。從圖1可以看出，目的條帶長(zhǎng)度為470 bp的引物未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，而由圖2可知，目的條帶長(zhǎng)度為425 bp的引物對(duì)豌豆、豇豆均出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。因此，選擇Mungbean_470 bp_F/R引物進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化分析。

圖1 Mungbean_470 bp_F/R引物特異性測(cè)試擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of Mungbean_470 bp_F/R

圖2 Mungbean_425 bp_F/R引物特異性測(cè)試擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of Mungbean_425 bp_F/R

2.2 PCR檢測(cè)體系參數(shù)的確立

調(diào)整、優(yōu)化PCR反應(yīng)程序，優(yōu)化退火溫度和引物濃度。結(jié)果表明(圖3)，Mungbean_470 bp_F/R引物在58 ℃退火溫度、0.4 μmol·L-1引物濃度下的擴(kuò)增效果最優(yōu)。最終確定擴(kuò)增反應(yīng)體為系25 μL： DNA模板(50 mg·L-1)1.0 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)2 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，35 個(gè)循環(huán)(95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸7 min，8 ℃保存。

圖3 PCR體系優(yōu)化結(jié)果Fig.3 PCR optimization results

2.3 靈敏度檢測(cè)

為了進(jìn)一步測(cè)試建立的綠豆源性成分定性PCR檢測(cè)方法的靈敏度，設(shè)置8個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(綠豆/小麥粉)的樣品，分別為100%、10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%和0%，每組重復(fù)3次。結(jié)果表明，在PCR檢測(cè)反應(yīng)體系中加入50 ng DNA模板時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5 %及以上的樣品擴(kuò)增條帶明顯(圖4)。

圖4 方法靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Sensitivity test results

2.4 檢出限檢測(cè)

稱取了60份綠豆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的樣品，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖5所示，60份試樣中均能穩(wěn)定檢測(cè)出470 bp的預(yù)期DNA片段。上述結(jié)果表明,在該P(yáng)CR檢測(cè)體系檢出限可達(dá)到0.5 %。

圖5 檢出限檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection limit detection results

2.5 市售綠豆糕中綠豆源性成分定性檢測(cè)

稱取市售綠豆糕樣品200 mg，放入微量離心管中，通過(guò)CTAB方法[12]提取得到DNA，溶于100 mL TE溶液中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以去離子水作為空白對(duì)照，產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。結(jié)果表明，在與對(duì)照綠豆凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，綠豆在470 bp處有1條DNA條帶，空白對(duì)照(CK)無(wú)條帶，說(shuō)明樣品中含綠豆成分(圖6)。空白對(duì)照和市售綠豆糕樣品各2個(gè)重復(fù)。

M: DNA Marker; CK:空白；1:綠豆糕樣品。 M:DNA Marker; CK:Control；1：Bean cake samples.

3 結(jié)論

本文探索設(shè)計(jì)了一種基于定性PCR的綠豆成分檢測(cè)方法。根據(jù)綠豆基因組特異性序列，設(shè)計(jì)PCR引物，并且對(duì)PCR反應(yīng)退火溫度、引物濃度等反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，使用Mungbean_470 bp_F/R引物、在58 ℃退火溫度、0.4 μmol·L-1引物食品加工品成分檢測(cè)具有良好的可操作性，檢出限可達(dá)到0.5%。本方法屬于定性檢測(cè)方法，對(duì)于產(chǎn)品中是否添加豇豆、大豆等成分，亦可以采用對(duì)應(yīng)的引物對(duì)這些豆類進(jìn)行檢測(cè)。采用PCR檢測(cè)法檢測(cè)綠豆成分，技術(shù)成熟、操作簡(jiǎn)單。

[1] 楊杰，高潔，苗虹.論食品欺詐和食品摻假[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41(12)：235-240.

[2] 張曉娜. 轉(zhuǎn)基因大豆MON87705及其產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)研究[D]. 濟(jì)南：山東師范大學(xué)，2015.

[3] 錢敏，黃敏欣，黃偉健，等. 電子舌和電子鼻在嬰兒奶粉檢測(cè)中的應(yīng)用 [J]. 中國(guó)乳品工業(yè)，2016，44(8)：58-60.

[4] 張紅梅，侯明濤，王淼森，等. 基于電子鼻技術(shù)的玉米氣味品質(zhì)檢測(cè)研究 [J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，50(3)：336-340.

[5] 劉威，劉偉麗，魏曉曉，等. 核磁共振波譜技術(shù)在食品摻假鑒別中的應(yīng)用研究 [J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2016，7(11)：4358-4363.

[6] 王君，劉蓉.近紅外光譜技術(shù)在液態(tài)食品摻假檢測(cè)中的應(yīng)用 [J]. 食品工業(yè)科技，2016, 37(7)：374-380.

[7] 徐文. 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在兩種中藥成分分析中的應(yīng)用[D]. 廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[8] 吉坤美, 陳家杰, 湯慕瑾, 等. 雙抗體夾心ELISA法測(cè)定食物中花生過(guò)敏原蛋白成分[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30(6)：110-114.

[9] XIN F, CHI Z. Detection of adulterated murine components in meat products by TaqMan real-time PCR [J]. Food Chemistry，2016, 192：485-490.

[10] 李溪盛，馬鶯. DNA指紋技術(shù)在食品摻假鑒定中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)甜菜糖業(yè)，2014(4)：44-50.

[11] 孔金明. 生物芯片技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用綜述 [J]. 鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2013，28(1)：1-6.

[12] 劉金華, 魏春艷, 馬立暉. 應(yīng)用RFLP特異基因片段檢測(cè)綠豆成分 [J]. 植物檢疫，2006，20(6)：336-338.

EstablishmentofspecificPCRformungbeaningredientsdetectioninfood

ZHAO Zhonglin1, LI Ruige1, QIN Zhiyang1,WANG Cheng2, WANG Yong2,YUAN Chao1,LAN Qingkuo2

(1.College of Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.Institute of Tianjin Agriculture Quality Standard and Testing Technology，Tianjin 300381, China)

A specific PCR method was established for mung bean composition detection in food. Specific primers were designed to detect the gene from mung bean composition. Primer concentrations of 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 and 1.0 μmol·L-1and annealing temperature of 52, 54, 56, 58, 60 and 62 ℃were tested to optimize the reaction condition. We also tested the sensitivity, specificity, and detection limits of this method. The results showed that the best annealing temperature and primer concentration were 58 ℃ and 0.4 μmol·L-1, respectively. The sensitivity of detection was 0.5%. The method was simple, fast and easy to operate. Due to its high specificity, it could provide a basis for food safety assessment.

food; mung bean ingredients; gel electrophoresis; PCR ; specificity detection

2017-06-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (31100067)

趙仲麟(1980-)，男，遼寧鞍山人，副教授，博士，從事化學(xué)生物學(xué)及分子生物學(xué)方面的研究。

蘭青闊(1980-)，男，河南南陽(yáng)人，副研究員，碩士。

1000-2340(2017)06-0867-04

TS214

A

蔣國(guó)良)