萼脊蘭AGAMOUS(AG)基因的克隆與表達分析

蔣素華， 鄧祖麗穎， 郝平安， 王默霏， 袁秀云， 崔 波

(1.鄭州師范學院生物工程研究所， 河南 鄭州 450044； 2.鄭州幼兒師范高等?？茖W校，河南 鄭州 450000； 3.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院， 河南 鄭州 450000)

萼脊蘭AGAMOUS(AG)基因的克隆與表達分析

蔣素華1， 鄧祖麗穎2， 郝平安3， 王默霏1， 袁秀云1， 崔 波1

(1.鄭州師范學院生物工程研究所， 河南 鄭州 450044； 2.鄭州幼兒師范高等專科學校，河南 鄭州 450000； 3.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院， 河南 鄭州 450000)

通過對萼脊蘭AGAMOUS(AG)基因進行結(jié)構(gòu)、功能分析、克隆和AG基因的表達調(diào)控等方面的探究，發(fā)現(xiàn)，萼脊蘭AG的氨基酸序列屬于植物特有的MIKC型MADS-box的C類基因，該基因cDNA全長1 002 bp，包含一個702 bp的開放閱讀框，該基因命名為AG(登錄號KY744276)，共編碼233個氨基酸。蛋白序列比對和進化樹分析表明，AG蛋白與蝴蝶蘭蛋白一致性最高，進化距離最近。二級結(jié)構(gòu)分析表明，該蛋白分子屬于親水性蛋白，其中α螺旋占48.93%，延伸鏈占11.59%，不規(guī)則卷曲占39.48%。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析表明，AG基因在花蕾和蕊柱中表達量很高，說明AG基因的表達具有組織特異性，在ABCDE模型中屬于C類基因的特征非常明顯，控制著雄蕊和雌蕊的發(fā)育。

萼脊蘭；AG基因克??；RACE技術(shù)；實時熒光定量PCR；表達分析

花器官是植物營養(yǎng)生長到生殖生長轉(zhuǎn)變過程中的重要功能器官，花器官發(fā)育遺傳機制的研究可以促進人們對被子植物花結(jié)構(gòu)的了解[1-2]。近年來，隨著分子生物學和細胞生物學等學科的發(fā)展，對花卉的基因以及育種的研究更加深入[3-5]。蘭科植物高度特化的花器官結(jié)構(gòu)，也使其成為研究花器官發(fā)育調(diào)控機制的理想材料[6-8]。蘭科植物相關(guān)基因特別是開花相關(guān)基因及其表達也成為當今研究的熱點，但對萼脊蘭開花相關(guān)基因的研究卻是剛剛起步[9]。在經(jīng)典的植物花發(fā)育的模型中最著名的是“ABCD”模型，1990年，YANOFSKY等[10]在擬南芥中首次克隆了花同源異型基因AGAMOUS(AG)，使AG基因成為最早被克隆的花的發(fā)育調(diào)控基因，針對擬南芥花發(fā)育調(diào)控基因的正向遺傳學研究，初步建立了簡單的花發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡模型。高志紅等[11]以擬南芥為試驗材料對AG基因的結(jié)構(gòu)、功能以及同源基因的分離和AG基因的表達調(diào)控等方面進行了系統(tǒng)闡述。AG基因作為重要的MADS基因之一，近年來對該基因的研究也更加深入。到目前為止，已從多種植物中分離克隆了AG同源基因全長cDNA[12]。AG基因是植物花發(fā)育模型中的C類基因，在調(diào)控植物花器官分化和發(fā)育中具有重要功能[13]，由于AG基因與植物的花器官特別是心皮、胚珠以及果實的發(fā)育密切相關(guān),因此對于種子植物的育種有著潛在的應用前景。在其他物種上AG基因同源基因研究多數(shù)是簡單的驗證擬南芥AG基因的功能，新的發(fā)現(xiàn)很少，要深入地了解AG基因的功能和物種之間的進化關(guān)系，需要更多的AG同源基因的數(shù)據(jù)。盡管在國際上開花調(diào)節(jié)基因AG是開花分子生物學的研究熱點，但中國這方面的研究報道較少[11]。因此，從萼脊蘭中克隆AG基因，闡明其在分子水平對萼脊蘭雌、雄蕊發(fā)育的調(diào)控機制，并從基因結(jié)構(gòu)和蛋白的理化特性探討基因功能，為進一步研究萼脊蘭的生殖生長提供重要的理論依據(jù)。本研究以萼脊蘭為試驗材料，通過RT-PCR及RACE技術(shù)獲得AG基因的全長序列，對其進行生物信息學分析，并對萼脊蘭AG基因的時空表達進行分析，為進一步研究AG基因在花分化與發(fā)育過程中的重要作用打下堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為萼脊蘭，采自鄭州師范學院蘭花工程研究中心，分別選取萼脊蘭苗期的根、葉；花蕾期的根、葉、花葶、花蕾；盛花期的根、葉、花葶、花瓣、萼片、蕊柱。

1.2 試劑和儀器

試劑：RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒(寶生物工程有限公司)，SYBR?Premix ExTaqTMII(寶生物工程有限公司)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程有限公司)；儀器：瓊脂糖凝膠電泳儀(P25T, 德國Biometra)，實時熒光定量PCR儀(realplex2, 德國Eppendorf)，微量紫外分光光度計(Q5000,美國Quawell)。

1.3 萼脊蘭總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

利用RNAprep pure試劑盒提取萼脊蘭不同時期不同組織總RNA，各取1.0 μL RNA樣品，通過1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測其完整性，利用Quawell Q5000微量紫外分光光度計檢測RNA濃度和質(zhì)量，以萼脊蘭花瓣總RNA為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈。

1.4 萼脊蘭AG基因克隆及生物信息學分析

根據(jù)GenBank中已登陸蘭科植物建蘭 (JN613149.1) 、文心蘭(KJ819939.1)、球花石斛(DQ017702.1)、姬蝴蝶蘭(AF234617.1)等的AG基因保守序列設計一對引物用于萼脊蘭AG基因保守序列的擴增，上游引物AG-F:CACAACAAAYAGRCAAGTCAC和下游引物AG-R: CTGGAATCAAAYGGAGGCATM，然后以萼脊蘭花瓣總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR擴增，切膠回收，再進行TA克隆，測序分析。以AG基因保守序列為模板，設計3’RACE和5’RACE引物，進行AG基因的RACE全長克隆。3’RACE引物序列：AG-F88: GGTTGCCCTAATCATCTTCTCTAC，AG-F220：TTCGCAGTATTACCAACAAGAG；5’RACE引物序列AGR114: CGGGTTGAGAAGATGATAAGGGCA，AGR158: TGGTTCCCTTCACGCTGTTGTTTG ，將克隆到的AG基因的核苷酸序列進行拼接，然后根據(jù)拼接的AG全長基因進行ORF的擴增，來驗證AG基因的正確性。AG基因的ORF克隆引物序列：AGORF-F2:ATGATGGAGAGCAAGGAAAAGA，AGORF-R2: ACCCAAGTTGCAGAGCTGTC，最后將正確的萼脊蘭AG基因與其他AG同源基因在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行blast搜索，并進行同源性比對分析；在NCBI的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫中搜索保守結(jié)構(gòu)域及功能域；用ProtScale軟件預測親疏水性；運用ExPASy網(wǎng)站上的GOR進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測；利用MEGA4.0軟件對其進行進化系統(tǒng)分析。

1.5 AG基因時空表達分析

根據(jù)AG基因序列設計出特異性較強的qRT-PCR引物，參照SYBR?Premix ExTaqTMII使用說明，用qRT-PCR的方法檢測AG基因在萼脊蘭不同發(fā)育階段不同部位的表達量，EF1a作為內(nèi)參基因，計算該基因的相對表達量。目的基因AG和內(nèi)參基因EF1a的退火溫度均為60 ℃，每個樣品3重復，蒸餾水為陰性對照，反應體系20 μL，反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，PCR結(jié)果按照相對表達量Rel. Exp=2-ΔΔCt計算，式中：ΔCt=Ct(AG)-Ct(EF1aRNA),ΔΔCt=(各植物組織ΔCt)-(花萼ΔCt)。qRT-PCR引物及參數(shù)見表1。

表1 qRT-PCR反應的引物參數(shù)Table 1 Primers Parameters for real time PCR

2 結(jié)果分析

2.1 AG基因全長cDNA克隆

以萼脊蘭花瓣cDNA為模板，利用設計的簡并引物AG-F和AG-R進行AG保守區(qū)基因片段的PCR擴增，擴增出一條長度約為600 bp的片段，該片段大小與預期目的條帶一致，測序結(jié)果得到567 bp的特異保守片段。采用RACE技術(shù)，利用3’端引物AG-F88和AG-F220擴增出3’端目的片段661 bp，用5’端引物AGR114和AGR158擴增出5’端目的片段303 bp。將保守域片段、3’端目的片段和5’端目的片段序列拼接，最終獲得大小為1 002 bp的AG全長cDNA序列，在開放閱讀框(ORF)區(qū)域設計引物，進行目的片段的擴增，得到了預期的片段702 bp，經(jīng)過與AG全長基因進行對比，結(jié)果顯示AG基因克隆正確(圖1)。將其核苷酸序列在NCBI上Blast分析，發(fā)現(xiàn)與蝴蝶蘭(DQ534013)的AG基因有較高一致性，為96%，將該基因命名為AG，提交GenBank，登錄號為KY744276。經(jīng)NCBI在線工具ORF Finder軟件查找，該基因具有 702 bp的完整開放閱讀框，5’端非編碼區(qū)為66 bp，3’端非編碼區(qū)為234 bp，編碼233個氨基酸(圖2)。

1：保守片段擴增；2：5′UTR擴增；3：3′UTR擴增；4：ORF擴增；M：Marker 2000。

1: Conserved region amplification; 2: Amplification products of 5′UTR;3: Amplification products of 3′UTR; 4: Amplification products of ORF; M: Marker 2000.

圖1AG基因擴增產(chǎn)物
Fig.1AmplificationproductsofAGgene

ATG:起始密碼子；TGA:終止密碼子。

ATG: Start codon； TGA: Stop codon.

圖2AG基因核苷酸序列和推測的氨基酸序列
Fig.2NucleotideacidsequenceanddeducedaminosequenceofAGgene

2.2 AG基因編碼的蛋白序列分析

AG氨基酸序列屬于植物特有的MIKC型C類MADS-box 基因，包含保守的MADS盒和中度保守的K盒(圖3)，其中MADS盒包含61個氨基酸組成的高度保守的結(jié)構(gòu)域，其編碼的 MADS 蛋白結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合靶DNA；中度保守的K盒包含91個氨基酸，主要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用，是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征序列。

采用ProtScale分析蛋白的親疏水性， 結(jié)果顯示,AG蛋白質(zhì)序列屬于親水性蛋白，其中第183位的Ala親水性最強(-2.989)，第51位Leu的疏水性最強(2.122)。采用ExPASy網(wǎng)站上的GOR進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果表明，α螺旋占48.93%，延伸鏈占11.59%，不規(guī)則卷曲占39.48%。將萼脊蘭AG基因編碼的氨基酸進行同源性分析，結(jié)果顯示，與蝴蝶蘭AG(AAL76415)同源性為99%，與建蘭AG(ADP00515)的同源性為94%，與石斛AG(AAY86364)的同源性為87%，反映出該基因在進化上較為保守(圖4)。

為了進一步研究萼脊蘭AG基因與其他植物MADS-box基因的進化關(guān)系，選取15種植物的MADS-box基因編碼的蛋白，利用MEGA4.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 (圖5)。結(jié)果表明，萼脊蘭AG與蘭科植物小蘭嶼蝴蝶蘭(AAL76415)MADS-box親緣關(guān)系最近，其次是球花石斛(AAY86364)AGAMOUS，建蘭(ADP00515)MADS1和文心蘭雜交栽培種(AIJ29176)AG-like。

圖3 萼脊蘭AG蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Sedirea japonica AG conservative protein domain structure

圖4 AG編碼的氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of the predicted amino acid sequence of AG

注：接點部位的值代表1 000 次重復的靴帶值。

Note： Values at nodes indicate bootstrap percentages.

圖5AG系統(tǒng)進化樹
Fig.5PhylogenetictreeforAG

2.3 萼脊蘭AG基因的時空表達分析

qRT-PCR分析結(jié)果顯示，AG基因的表達具有組織特異性：苗期，在葉和根中AG基因表達幾乎為零；花蕾期，葉和根中AG基因的表達量也幾乎為零，在花葶中少有表達，在花蕾中表達量很高；盛花期，AG基因的表達有明顯組織特異性，葉和根中不表達，花葶、萼片、花瓣中表達量很少，在蕊柱中卻大量表達(圖6)，說明AG基因在ABCDE模型中屬于C類基因的特征非常明顯，控制著雄蕊和雌蕊的發(fā)育。

圖6 AG 基因的時空表達分析Fig.6 AG expression Analysis at different period and tissue

3 結(jié)論與討論

AG基因參與花分生組織形成并控制第 3，4 輪花器官的發(fā)育, 在生殖生長過程中對于維持花原基特征是必需的。本研究采用RT-PCR和RACE相結(jié)合的手段克隆了蘭科植物萼脊蘭AG基因的全長序列，并對其進行了生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)AG基因全長1 002 bp，AG氨基酸序列屬于植物特有的MIKC型MADS-box基因，包含典型的MADS盒、K盒，AG的氨基酸序列與蝴蝶蘭(AAL76415)同源性為99%，屬于親水性蛋白， 與蘭科植物蝴蝶蘭MADS-box親緣關(guān)系最近。

AG基因的時空表達分析的結(jié)果顯示，AG基因的表達具有組織特異性，在花蕾和蕊柱中表達量最高，說明AG具有C類基因功能的同源異形基因，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 調(diào)控雄蕊和心皮原基的發(fā)育。

陳新等[14]從平榛花芽中分離克隆獲得平榛AG的同源基因ChAG，經(jīng)生物信息學軟件分析，AG基因編碼區(qū)保守性較強，不同科植物間氨基酸水平上的同源較高，說明AG基因在榛屬植物進化過程中是比較保守的。本研究發(fā)現(xiàn)，萼脊蘭AG所編碼的氨基酸序列與蝴蝶蘭的同源性為99%，與建蘭同源性為94%，與石斛的同源性為87%，說明萼脊蘭AG基因編碼區(qū)保守性較強，在蘭科植物進化過程中比較保守，研究結(jié)果與陳新等[14]的研究比較一致。劉鍇棟等[15]從番荔枝中分離花器官特征決定基因AGAMOUS，并研究AG基因在花發(fā)育不同時期、不同器官及不同激素信號分子處理下的表達特性，推測番荔枝AsAG可能參與雌蕊和雄蕊的發(fā)育及激素信號的響應。本研究發(fā)現(xiàn)AG基因的表達量主要在花蕾和蕊柱，也推測AG可能參與雌蕊和雄蕊的發(fā)育，這與劉鍇棟等[15]的研究較為一致。徐雷等[16]利用病毒誘導的基因沉默技術(shù)研究了豌豆AGAMOUS同源基因(PsAG)的功能，驗證了花發(fā)育早期PsAG的表達特異性，本研究利用實時熒光定量PCR技術(shù)，從另一個角度驗證了AG基因的表達組織特異性，與徐雷等[16]的研究吻合。盡管如此，由于一些未知基因的存在和研究手段的限制，AG基因的功能和與其上下游基因的相互關(guān)系還不是很清楚，有些結(jié)論還僅僅是推測，沒有直接的證據(jù)證明,AG基因的調(diào)控體系還沒有完全闡明[17-18]。目前大多數(shù)結(jié)論建立在雙子葉植物和草本植物的研究基礎之上，在其他物種上AG基因同源基因的研究多數(shù)是簡單地驗證擬南芥AG基因的功能，新的發(fā)現(xiàn)很少，要更深入地了解AG基因的功能和物種之間的進化關(guān)系，需要更多的AG同源基因的數(shù)據(jù)。

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AnalysisofcloningandexpressionanalysisofAGAMOUSgenefromSedireajaponica

JIANG Suhua1, DENGZU Liying2, HAO Pingan3,WANG Mofei1, YUAN Xiuyun1, CUI Bo1

(1.Institute of Bioengineering, Zhengzhou Normal University, Zhengzhou 450044, China; 2.Zhengzhou Preschool Education College, Zhengzhou 450000, China; 3.College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450000, China)

The structure, function, clone ofAGAMOUS(AG) gene as well as its expression regulation were studied in this paper.It's found that the amino acid sequence ofAGbelonged to plant type peculiar MIKC, C gene of MADS-box class. The full length cDNA ofAGwas 1 002 bp with an ORF of 702 bp encoding 233 putative amino acid residues (GenBank：KY744276). Multiple sequence alignments and phylogenetic tree analyses showed thatAGwas close to thephalaenopsisamabiliswith an overall sequence similarity. The encoded protein was hydrophilic and contained 48.93% of α-helical domains, 11.59% of extended strand, 39.48% of random coil. The highest expression of the gene analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR was in bud and stigma. It indicated thatAGgene expression was tissue specificity, belonged to the class C gene characteristics in ABCDE model, and controlled the development of stamen and pistil.

Sedireajaponica;AGgene cloning; RACE; real-time fluorescentquantitative PCR; gene expression

2017-04-18

河南省高等學校重點科研項目(14B180036)；鄭州市科技發(fā)展計劃項目(20150448)；鄭州市普通科技攻關(guān)項目(141PPTGG420)

蔣素華(1983-)，女，河南漯河人，講師，碩士，主要從事花卉分子生物學研究。

崔 波(1962-)，男，河南泌陽人，教授，博士。

1000-2340(2017)06-0801-07

Q786

A

朱秀英)