農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化與應(yīng)用

張 磊， 李國(guó)領(lǐng)， 張建周， 張德奇

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研管理處，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，河南 鄭州 450002)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化與應(yīng)用

張 磊1， 李國(guó)領(lǐng)2， 張建周2， 張德奇2

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研管理處，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，河南 鄭州 450002)

為了優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，以鄭麥9023幼胚愈傷組織為材料，研究了60Co γ射線輻照對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明，在輻照劑量為4 Gy，輻照處理后以繼代培養(yǎng)24 h時(shí)β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因瞬時(shí)表達(dá)率最高。負(fù)壓抽拉處理結(jié)果表明，抽拉10次可明顯提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)基因抗性再生植株bar基因分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明，利用改良的遺傳轉(zhuǎn)化處理方法(4 Gy輻照+輻照后培養(yǎng)24 h+負(fù)壓抽拉處理10次)，可將遺傳轉(zhuǎn)化效率由2.2%提高至3.5%，優(yōu)化后的小麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法可應(yīng)用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化。

小麥；再生體系；農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化；輻照；負(fù)壓處理；GUS瞬時(shí)表達(dá)

小麥?zhǔn)鞘澜绶秶鷥?nèi)的主要糧食作物，建立高效、成熟的小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)于詮釋小麥重要性狀相關(guān)基因的功能和定向遺傳改良具有重要意義?；驑屴D(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是遺傳轉(zhuǎn)化小麥最主要的兩種方法。1992 年，VASIL等[1]將β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)和除草劑抗性基因(bar)通過(guò)基因槍法導(dǎo)入小麥品種“Paron”，獲得對(duì)除草劑 Basta 有抗性的再生植株，是首例基因槍轉(zhuǎn)化小麥成功事件。與基因槍法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以可轉(zhuǎn)移較大的 DNA 片段、成本低、無(wú)需復(fù)雜的原生質(zhì)體培養(yǎng)、導(dǎo)入外源基因以單拷貝數(shù)居多、再生植株無(wú)育性問(wèn)題等諸多優(yōu)點(diǎn)逐漸成為植物遺傳轉(zhuǎn)化的有效方法[2]。1997 年CHENG等[3]首次通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥轉(zhuǎn)化體系得到了世界上第一例轉(zhuǎn)化成功的小麥。2003年WU等[4]又對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化的相關(guān)因素進(jìn)行了優(yōu)化研究，進(jìn)一步提升了小麥的遺傳轉(zhuǎn)化效率。此后，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者就如何提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率開(kāi)展了大量研究，包括強(qiáng)感染力菌株的選擇、農(nóng)桿菌活性、菌液濃度、浸染時(shí)間、共培養(yǎng)條件、激素與表面活性劑的選擇等均不同程度地影響轉(zhuǎn)化效率[5-13]。此外，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)其他作物遺傳轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，采取輻照、負(fù)壓、外植體致傷等輔助處理可提高轉(zhuǎn)化頻率[14-15 ]，但上述手段在小麥的遺傳轉(zhuǎn)化中尚未見(jiàn)報(bào)道。作者在開(kāi)展農(nóng)桿菌介導(dǎo)結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)，輻照和負(fù)壓處理可顯著提升遺傳轉(zhuǎn)化效率[15]。因此，本文研究了輻照和負(fù)壓處理對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系的影響，以期為提高小麥的遺傳轉(zhuǎn)化效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所利用的小麥品種為鄭麥9023，農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404， 植物表達(dá)載體T-DNA 區(qū)帶有由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gus、卡那霉素抗性基因nptⅡ、草丁膦抗性基因bar。以上試驗(yàn)材料均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所保存。

1.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

小麥材料幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)參見(jiàn)李艷[16]的方法，幼胚取自開(kāi)花后12～14 d的穗中部籽粒，用體積分?jǐn)?shù)為 70%的無(wú)水乙醇消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的HgCl2消毒10 min，無(wú)菌水沖洗3～4次。在超凈工作臺(tái)上用解剖鑷剝出幼胚(約1 mm)，幼胚盾片朝上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

愈傷誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基參照彭亞博等[13]和張磊等[15]的方法。

愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2 mg·L-1Picloram；根癌農(nóng)桿菌YEP液體培養(yǎng)基：10 g·L-1牛肉浸膏+10 g·L-1酵母浸出物+5 g·L-1NaCl；農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)液：1/10 MS+0.75 g·L-1MgCl2+0.02% Silwet-77+200 μmol·L-1AS+0.1 g·L-1肌醇；預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)基：1/10 MS+2 mg·L-1Picloram+0.75 g·L-1MgCl2+0.02% Silwet-77+200 μmol·L-1AS+0.1 g·L-1肌醇；恢復(fù)培養(yǎng)基：MS+2 mg·L-1Picloram+250 mg·L-1羧芐青霉素+0.1 g·L-1肌醇；常規(guī)再生培養(yǎng)基(非遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn))：MS+1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA+0.1 g·L-1肌醇。篩選再生培養(yǎng)基(轉(zhuǎn)基因試驗(yàn))：MS+1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA+250 mg·L-1羧芐青霉素+6 mg·L-1PPT+0.1 g·L-1肌醇。

1.3 農(nóng)桿菌培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化參見(jiàn)張磊等[15]的方法，將農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600值約為0.6，將誘導(dǎo)的愈傷組織浸泡10 min，用無(wú)菌濾紙吸去多余菌液，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于25 ℃、16 h光照/ 8 h黑暗下共培養(yǎng)2 d。用含500 mg·L-1羧芐青霉素的無(wú)菌水洗凈，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基，每2周繼代培養(yǎng)1次。GUS組織化學(xué)染色參照彭亞博等[13]的方法，并利用GUS染色反應(yīng)計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

1.4 輻照處理

取繼代2周、大小較為一致的胚愈傷組織，于河南省科學(xué)院同位素研究所有限責(zé)任公司輻照中心按劑量率1 Gy·min-1進(jìn)行如下2種方式輻照：以1、2、4、8、16 和32 Gy劑量的60Co γ射線輻照，以未輻照材料為對(duì)照，輻照后直接用于農(nóng)桿菌感染轉(zhuǎn)化；以4 Gy劑量的60Co γ射線處理，輻照后轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)0、12、24、36、48和60 h，然后進(jìn)行農(nóng)桿菌的感染轉(zhuǎn)化。

1.5 負(fù)壓處理

將愈傷組織放入含有農(nóng)桿菌菌液的醫(yī)用注射器，將注射器一端封閉，參照張磊等[15]的方法，分別抽拉5、10、20和40次，抽拉距離每次為5 cm，每次間隔5 s，浸泡10 min，以未抽拉材料為對(duì)照。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株分子標(biāo)記檢測(cè)

選擇bar基因作為轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)基因進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)。bar基因PCR檢測(cè)參照李艷[16]的方法，BP1: 5′-CCATCGTCAACCACTACATC-3′和BP2：5′-ATGCCAGTTCCCGTGCTTGA-3′，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃， 5 min；94 ℃， 30 s；53 ℃ ，30 s；72 ℃， 30 s；35個(gè)循環(huán)；72 ℃， 10 min。目的片段長(zhǎng)度為408 bp。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

GUS表達(dá)率=(GUS表達(dá)愈傷組織塊數(shù)/感染總愈傷組織塊數(shù))×100%；抗性愈傷率=(抗性愈傷組織塊數(shù)/供試愈傷組織塊數(shù))×100%；再生植株bar基因陽(yáng)性率=bar基因PCR分子標(biāo)記檢測(cè)的陽(yáng)性植株數(shù)/農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷組織數(shù)。

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Microsoft Excel 2003繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照對(duì)小麥愈傷組織及其轉(zhuǎn)化的影響

2.1.1 輻照對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響 由圖1可知，不同輻照劑量顯著影響GUS瞬時(shí)表達(dá)率。在1～8 Gy的輻照量區(qū)間內(nèi)，隨劑量的遞增GUS瞬時(shí)表達(dá)率均顯著高于對(duì)照的65.3%，其中4 Gy和8 Gy輻照劑量瞬時(shí)表達(dá)率分別達(dá)到95.0%和96.5%；在16～32 Gy的輻照量區(qū)間內(nèi)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率逐漸降低。GUS組織化學(xué)染色觀察也表明，在1～8 Gy范圍內(nèi)，GUS染色逐漸加深，高于8 Gy輻照染色逐漸變淺。

圖1 不同輻照劑量對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響Fig.1 The effects of gamma irradiation on GUS transient expression rate of calli

2.1.2 輻照對(duì)小麥繼代2周愈傷組織存活率的影響 雖然GUS瞬時(shí)表達(dá)率和染色情況以8 Gy最為理想，但該處理的愈傷組織存活率卻低于4 Gy的處理(圖2)。1～4 Gy低劑量輻照，可顯著促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)，高于8 Gy輻照則明顯抑制愈傷組織的生長(zhǎng)，并且褐化現(xiàn)象比較嚴(yán)重。因此，考慮到輻射可能對(duì)愈傷組織的誘變作用，選用4 Gy作為最佳的輻照劑量。

2.1.3 輻照后繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織轉(zhuǎn)化的影響 愈傷組織進(jìn)行輻照后不同繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)小麥遺傳轉(zhuǎn)化也有較大影響(圖3)。輻照后培養(yǎng)24 h時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，達(dá)到96.8%，隨后瞬時(shí)表達(dá)率迅速下降。因此，綜合上述輻照劑量的結(jié)果，選擇輻照4 Gy，輻照后繼代培養(yǎng)24 h作為最佳的輻照及繼代培養(yǎng)條件，可顯著提高愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率。

圖2 不同輻照劑量對(duì)愈傷組織存活率的影響Fig.2 The effects of different gamma irradiation on survival rate of calli

圖3 輻照后繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響

2.2 負(fù)壓處理對(duì)小麥繼代2周愈傷組織轉(zhuǎn)化率的影響

農(nóng)桿菌菌液浸泡愈傷組織過(guò)程中利用密閉的注射器分別進(jìn)行了5、10、20和40次的負(fù)壓抽拉處理(圖4)，未負(fù)壓處理愈傷組織作為對(duì)照。負(fù)壓抽拉次數(shù)顯著影響GUS瞬時(shí)表達(dá)率。其中，抽拉10次時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)到86.9%，顯著高于對(duì)照的67.3%。當(dāng)負(fù)壓抽拉處理超過(guò)20次時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率明顯降低。在農(nóng)桿菌菌液侵染后的繼代培養(yǎng)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，負(fù)壓抽拉處理為10次時(shí)，農(nóng)桿菌的污染控制與常規(guī)未負(fù)壓處理相當(dāng)，但抽拉次數(shù)超過(guò)20次后，農(nóng)桿菌的污染則較難控制，這可能是由于抽拉次數(shù)過(guò)多后農(nóng)桿菌菌液深入滲透至愈傷組織內(nèi)部間隙中，導(dǎo)致殘存在愈傷組織內(nèi)部的農(nóng)桿菌菌液難以清理干凈。因此，選擇抽拉10次作為最佳的負(fù)壓處理方式。

圖4 負(fù)壓抽拉次數(shù)對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響Fig.4 The effects of pulling times on GUS transient expression rate of calli

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得與分子鑒定

以鄭麥9023幼胚愈傷組織為試驗(yàn)材料，以常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化方法為對(duì)照，利用優(yōu)化的轉(zhuǎn)化方法(4 Gy輻照+輻照后培養(yǎng)24 h+負(fù)壓抽拉處理10次)對(duì)愈傷組織進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化。2種方法各侵染了1 500塊幼胚愈傷組織(每次500塊愈傷組織，重復(fù)3次)?？剐栽偕仓甑腷ar基因PCR檢測(cè)結(jié)果表明(圖5)，利用改良方法共獲得52株陽(yáng)性植株，bar基因陽(yáng)性率比例達(dá)到3.5%，顯著高于常規(guī)處理的33株陽(yáng)性植株和2.2%的陽(yáng)性率(圖6)。

M：Marker；1：質(zhì)粒對(duì)照；2：未轉(zhuǎn)化對(duì)照；3～10：T0代轉(zhuǎn)基因植株M: Marker; 1: Plasmid; 2: Non-transgenic plant; 3～10: Regeneration basta resistant plants圖5 T0代轉(zhuǎn)基因植株的bar基因PCR檢測(cè)Fig.5 PCR analysis of T0 transgenic wheat plants by bar gene primers

3 結(jié)論與討論

遺傳轉(zhuǎn)化的過(guò)程是農(nóng)桿菌菌株與植物細(xì)胞之間互相作用的結(jié)果，凡是能夠影響植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化應(yīng)答能力和農(nóng)桿菌侵染能力以及轉(zhuǎn)化體再生能力的各種因素都會(huì)對(duì)其轉(zhuǎn)化效果產(chǎn)生影響，而且對(duì)于不同的物種甚至同一物種不同轉(zhuǎn)化材料而言都有非常大的差異。因此，優(yōu)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化頻率的主要影響因子對(duì)于獲得高效的轉(zhuǎn)化頻率尤為重要[17]。

圖6 改良方法與常規(guī)方法的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)陽(yáng)性率Fig.6 Positive transgenic plant rate of improved and normal method

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化依賴于高效的再生體系和高頻轉(zhuǎn)化體系。遺傳轉(zhuǎn)化理想的基因型應(yīng)是組織培養(yǎng)再生性能好、綜合性狀優(yōu)良并具有推廣價(jià)值或潛在推廣價(jià)值的優(yōu)良品種品系?；蛐褪怯绊懶←溤偕w系的重要因素，不同基因型其愈傷誘導(dǎo)率和再生頻率差異很大。前人關(guān)于小麥不同主栽品種開(kāi)展過(guò)大量的組培特性研究，篩選出了一批農(nóng)藝性狀優(yōu)良、再生體系高效的品種[18]。而農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵性因素在于轉(zhuǎn)化受體與農(nóng)桿菌的互作狀態(tài)[15]。以往農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，開(kāi)展了大量對(duì)農(nóng)桿菌菌株、菌液活性、濃度、感染時(shí)間等方面的研究[4-13]，其他物種通過(guò)機(jī)械、超聲和酶解等物理和化學(xué)輔助手段導(dǎo)致受體細(xì)胞的損傷以提高轉(zhuǎn)化頻率也有一些研究[14-15]。γ射線輻射可以引起植物DNA、細(xì)胞、組織等不同水平的損傷，但低劑量的電離輻射對(duì)植物也具有正向的刺激效應(yīng)，例如可以提高種子的發(fā)芽力、破除種子休眠、加強(qiáng)對(duì)逆境脅迫的抵御能力、刺激發(fā)育等[19-21]。在以前的研究中，低劑量輻照可以明顯提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的結(jié)縷草愈傷組織轉(zhuǎn)化效率[15]。但與結(jié)縷草最佳劑量 2 Gy不同的是，農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥的最佳劑量為4 Gy，表明不同物種之間的最佳劑量存在差異。

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，盡管經(jīng)過(guò)清洗，但外植體表面及細(xì)胞間隙中仍附著部分殘余農(nóng)桿菌，如何在選擇過(guò)程中殺死殘余農(nóng)桿菌對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程至關(guān)重要。在預(yù)備試驗(yàn)中，通過(guò)優(yōu)化條件獲得了一系列的方法來(lái)盡量消除殘余農(nóng)桿菌的過(guò)度繁殖問(wèn)題：共培養(yǎng)基上鋪放2～3層無(wú)菌濾紙可以有效降低農(nóng)桿菌的殘存，而且對(duì)轉(zhuǎn)化頻率基本沒(méi)有影響；共培養(yǎng)結(jié)束后清洗農(nóng)桿菌時(shí)，改手搖方式為放置于搖床上(200 r·min-1)振蕩 2 h，重復(fù)2次。該方法只適用于愈傷組織結(jié)構(gòu)較為致密的材料，不適于結(jié)構(gòu)松散的愈傷組織。

gus基因瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)常常被用于優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系及考察啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度，但gus基因的表達(dá)是否代表遺傳轉(zhuǎn)化的最終轉(zhuǎn)化效率尚無(wú)定論。作者在優(yōu)化小麥轉(zhuǎn)化體系中觀察到，GUS瞬時(shí)表達(dá)強(qiáng)度大的條件下往往獲得抗性愈傷的比例也較高。因此，在試驗(yàn)過(guò)程中仍用該指標(biāo)對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行評(píng)價(jià)。

綜上所述，輻照和負(fù)壓處理可顯著提高GUS瞬時(shí)表達(dá)率和愈傷組織存活率，其中4 Gy輻照+輻照后培養(yǎng)24 h+負(fù)壓抽拉處理10次為最佳處理方式；利用改良的遺傳轉(zhuǎn)化處理方法可將遺傳轉(zhuǎn)化效率由2.2%提高至3.5%。

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Improvementandapplicationofagrobacteriummediatedgenetictransformationofwheat

ZHANG Lei1, LI Guoling2, ZHANG Jianzhou2, ZHANG Deqi2

(1.Department of Scientific Research Management, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China; 2.Wheat Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China)

In order to optimize the method of wheat agrobacterium mediated genetic transformation, the embryonic calli derived from the immature embryos of a wheat cultivar “Zhengmai 9023” were used as materials, to study the effects of gamma irradiation on agrobacterium-mediated genetic transformation. The results indicated that 4 Gy is the optimal dose for agrobacterium-mediated genetic transformation of Zhengmai 9023, using GUS transient expression rates as the indicator. Based on the survival rate and GUS transient expression rate, further observation found that 24 hours reculture after gamma irradiation is the most appropriate for agrobacterium infection. Another negative pressure treatment results showed that pulling 10 times in enclosed injector was the optimal manner for transformation. Bar gene PCR assay results of positive regeneration plantlets showed that transformation efficiency was enhanced from 2.2% to 3.5% by using the improved method (4 Gy irradiation+24 h reculture+10 times negative pressure treatment) described above. The optimied agrobacterium-mediated transformation method can be used in the genetic transformation of wheat.

wheat; regeneration system; agrobacterium; genetic transformation； gamma irradiation; negative pressure treatment; GUS transient expression

2017-07-20

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31371707)

張 磊(1979-),男，安徽蒙城人，副研究員，博士，主要從事小麥遺傳育種方面的研究。

1000-2340(2017)06-0781-05

S 512.1

A

李 瑩)