花生種子在不同發(fā)育時(shí)期油體的顯微結(jié)構(gòu)分析

王允，劉婷，和小燕，張幸果，馬興立，殷冬梅

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 45002)

花生種子在不同發(fā)育時(shí)期油體的顯微結(jié)構(gòu)分析

王允，劉婷，和小燕，張幸果，馬興立，殷冬梅

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 45002)

為進(jìn)一步探討子葉細(xì)胞內(nèi)油體與含油量的關(guān)系，采用尼羅紅染色和激光共聚焦技術(shù)相結(jié)合的方法觀察不同含油量品種(花U 606和花17)在種子發(fā)育及萌發(fā)后不同時(shí)期油體的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明，2個(gè)品種中油體的變化趨勢基本一致，只在油體數(shù)量及大小上差異明顯。隨著花生種子的發(fā)育，油體逐漸增多，直至充滿整個(gè)細(xì)胞且體積變大。萌發(fā)后隨著油脂的降解，油體數(shù)量逐漸減少，30 d時(shí)僅在細(xì)胞壁周圍有油體分布。通過對花生子葉細(xì)胞內(nèi)油體含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著種子的發(fā)育，油體數(shù)量逐漸增加，油體含量也逐漸增加；而在種子萌發(fā)后不同階段，油體的數(shù)量逐漸減少，油體含量也逐漸減少。結(jié)合子仁不同發(fā)育及萌發(fā)后不同時(shí)期含油量的變化可知，油體含量越高，含油量越高；反之，油體含量越低，含油量也越低。

花生；激光共聚焦技術(shù)；含油量；油體

在植物種子內(nèi), 脂類物質(zhì)一般是以三酰甘油酯(TAG)的形式貯存在油體內(nèi)[1]。在種子發(fā)育過程中, 油體主要集中在子葉、胚乳或盾片等貯藏組織中[2-3]，主要包括TAG、外部的磷脂單分子層和油體相關(guān)蛋白3個(gè)部分，油體的直徑很小，通常為0.5～2.5 μm，但也有例外，如經(jīng)濟(jì)作物可可的油體直徑可達(dá)7 μm[4]。近年來，許多對油體的研究報(bào)道主要集中在油體的數(shù)量、形態(tài)大小及油體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能上。韋存虛等[5]對油菜種子中胚子葉細(xì)胞內(nèi)的油體進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小油體數(shù)量較多，大油體數(shù)量較少，且隨著油體體積的增加,油體的數(shù)量隨之減少。TZEN等[6]研究發(fā)現(xiàn)，油體體積小時(shí)能提高酯酶的作用面積，并能增強(qiáng)TAG的流動(dòng)性。TING等[7]發(fā)現(xiàn)，在高油玉米中含有較大的油體及較高的TAG/油體蛋白比。SILOTO等[8]采用RNAi技術(shù)在擬南芥中發(fā)現(xiàn)種子胚中油體異常大，種子的含油量和蛋白質(zhì)含量也發(fā)生了改變。在油菜種子中發(fā)現(xiàn)，油體蛋白質(zhì)含量的減少引起油體異常增大，含油量降低[9]。SILOTO等[8]認(rèn)為，在擬南芥中油體蛋白質(zhì)的積累決定油體的大小。這些研究結(jié)果都表明，油體蛋白質(zhì)在調(diào)控油體大小方面起著重要作用，且在種子萌發(fā)時(shí)油體蛋白質(zhì)能阻止油體的異常融合從而增強(qiáng)種子的抗寒能力[10]。近年來,人們對油體產(chǎn)生、油體數(shù)量與形態(tài)及油體與含油量的關(guān)系等方面進(jìn)行了探討研究，針對油體和含油量的關(guān)系，研究者有兩種不同的觀點(diǎn)：一種認(rèn)為油體越大含油量越高,二者呈正相關(guān)；而另一觀點(diǎn)則認(rèn)為油體與含油量之間是存在一定關(guān)系，但并非是正負(fù)相關(guān)這么簡單。HENEEN等[11]觀察燕麥胚乳發(fā)育過程中油體形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小油體逐漸融合成大油體，其認(rèn)為油體的大小與含油量呈正相關(guān)。董勁松等[12]通過對不同含油量的甘藍(lán)型油菜油體數(shù)量的研究觀察發(fā)現(xiàn),在單個(gè)子葉細(xì)胞內(nèi),高低油組分間無論油體數(shù)量還是油體截面積之和都存在顯著差異，油體的數(shù)量和總面積與含油量呈正相關(guān)。含油量較低時(shí)細(xì)胞內(nèi)也可存在體積較大的油體[9]。SILOTO等[8]研究發(fā)現(xiàn)，種子內(nèi)油體數(shù)量和大小的改變影響油脂的含量。目前大家普遍認(rèn)同這一觀點(diǎn)。盡管前人在不同的作物中對油體的產(chǎn)生、數(shù)量和形態(tài)等進(jìn)行了大量研究，但關(guān)于花生子仁中不同發(fā)育階段油體的數(shù)量、形態(tài)及分布等還不清楚，因此，本試驗(yàn)分別在花生子仁發(fā)育及萌發(fā)后選取4個(gè)特定階段，利用激光共聚焦掃描電鏡對花生不同發(fā)育及萌發(fā)后子葉細(xì)胞的油體進(jìn)行觀察，并統(tǒng)計(jì)其油體截面積，以期進(jìn)一步探討花生中含油量與油體的關(guān)系，為花生高油品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

花生品種(ArachishypogaeaL．)花U 606和花17由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)花生研究室提供，花U 606屬于普通早熟高油花生，花17為普通含油量花生品種。

1.2 取材方法

1.2.1 花生子仁不同發(fā)育時(shí)期的取材方法 以高油品種花U 606和普通品種花17為研究對象,所需試驗(yàn)材料種植在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)，在莢果發(fā)育過程中依據(jù)果針入土?xí)r間和子仁大小將花生仁分成4個(gè)不同的發(fā)育時(shí)期(果針入土后20 ，40 ，60，80 d)，每個(gè)發(fā)育時(shí)期取樣重復(fù)3次，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 子仁萌發(fā)后不同時(shí)期的取樣方法 仍以花U 606和花17為研究對象，從2個(gè)材料中選取飽滿且大小一致的子仁各40粒，完全浸泡4 h后轉(zhuǎn)到培養(yǎng)瓶中加入適量的水，置于25 ℃的培養(yǎng)箱中催芽，以后每天換水，在其萌發(fā)后1個(gè)月內(nèi)取樣4次(萌發(fā)后5，10，20，30 d)，3次重復(fù)。

1.3 花生不同發(fā)育時(shí)期子仁和萌發(fā)后子葉的觀測

取花后時(shí)間(DAF)20，40，60，80 d的子仁和萌發(fā)后時(shí)間(DAG)5，10，20，30 d的子葉觀察其生長情況。用天平稱量不同時(shí)期花生子仁的質(zhì)量，計(jì)算子仁在不同時(shí)期中的鮮質(zhì)量變化。稱鮮質(zhì)量后，放在105 ℃烘箱中烘2 h，然后在60 ℃烘箱中烘至質(zhì)量恒定，取出后放到干燥器中冷卻，稱其干質(zhì)量。

1.4 激光共聚焦掃描切片制作與觀察

取5 mg尼羅紅溶于5 mL丙醇中，得到質(zhì)量濃度為1 g·L-1的尼羅紅母液，然后分裝，并于4 ℃避光保存，取尼羅紅母液用超純水稀釋到5 mg·L-1。取不同發(fā)育及萌發(fā)后時(shí)期的花生子仁，徒手切片(盡量薄)，放于稀釋好的尼羅紅染液中黑暗溫育15 min，后用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，洗去多余染料，制片，用激光共聚焦顯微鏡在激發(fā)波長為543 nm時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)的油體。

1.5 圖片處理與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用image軟件的測量功能測定花生不同發(fā)育及萌發(fā)后單個(gè)子葉細(xì)胞內(nèi)油體截面積之和。每個(gè)時(shí)期選取5個(gè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)油體截面積統(tǒng)計(jì)，設(shè)定：油體含量=單個(gè)細(xì)胞內(nèi)油體截面積之和/整個(gè)細(xì)胞的面積×100%，比較含油量與油體含量的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生子仁不同發(fā)育及萌發(fā)后時(shí)期的形態(tài)特征

花U 606和花17品種在子仁發(fā)育階段及萌發(fā)后形態(tài)上趨勢大體相同。對不同發(fā)育時(shí)期花生子仁鮮質(zhì)量及干質(zhì)量進(jìn)行測定可發(fā)現(xiàn)(表1)，花生子仁的干質(zhì)量在花后20～40 d增加緩慢；在40～80 d其子仁干質(zhì)量迅速增加。這一結(jié)果表明，花生子仁在花后40～80 d，其內(nèi)部貯藏物質(zhì)迅速增加，是花生子仁發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期。在萌發(fā)后階段，其子仁的干質(zhì)量一直減少。此現(xiàn)象表明，花生子仁內(nèi)部的貯藏物質(zhì)是為維持種子的萌發(fā)及植株的生長而逐漸消耗的。

表1 花生不同發(fā)育時(shí)期子仁的干鮮質(zhì)量Table 1 The fresh weight of peanut pods and seeds at different developmental stages g ·莢-1

2.2 不同發(fā)育時(shí)期花生子葉細(xì)胞中油體的分布及比較

花生子仁中油脂貯存于油體中，油體能被尼羅紅染色，在激光共聚焦顯微鏡下，油體都染成紅色的圓球形。在不同發(fā)育時(shí)期不同含油量花生品種子仁中子葉細(xì)胞內(nèi)油體的變化不盡相同。使用共聚焦顯微鏡觀察花生子仁在不同時(shí)期油體的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明(圖1)，花后20 d在子仁的子葉細(xì)胞中已經(jīng)有清晰可見的油體，但數(shù)量很少，油體體積比較小，油體間的空隙大且沿細(xì)胞壁分布(圖1 A)，花U 606和花17子葉細(xì)胞中的油體分布、形態(tài)大小及數(shù)量差別不大?；ê?0 d相較于花后20 d子葉細(xì)胞而言，油體依然分布在細(xì)胞壁兩側(cè)，但數(shù)量增多，逐漸向細(xì)胞中間分布，油體體積也增大，且其外形變得更為圓潤飽滿。比較發(fā)現(xiàn)，花U 606中的油體數(shù)量比花17中多(圖1 B、圖1 F)；在花后40～60 d油體繼續(xù)向細(xì)胞中間分布，油體數(shù)目進(jìn)一步增多，油體空隙也進(jìn)一步縮小(圖1 C、圖1 G)，花U 606中油體數(shù)目仍比花17中多，且有較大的油體出現(xiàn)。在花后60～80 d油體的數(shù)量不斷增加，分布緊密且充滿整個(gè)子葉細(xì)胞(圖1 D、圖1 H)，相比之下，花U 606中油體的分布更為緊密，油體數(shù)量明顯高于花17，花17中油體分布稍微分散且有少許空洞?？偟膩碚f，在花生子仁發(fā)育過程中花U 606和花17在油體分布及變化趨勢上是一致的，只是隨著發(fā)育進(jìn)程細(xì)胞內(nèi)油體的數(shù)量及大小上有所差異。

其中A,B,C,D分別代表U606花后20 DAG，40 DAG，60 DAG，80 DAG; E,F,G,H分別代表花17花后20 DAG,40 DAG,60 DAG,80 DAG。A,B,C,D stand for days after flowering(DAG) (20,40,60 and 80DAG) of Hua U 606,respectively; E,F,G,H stand for days after flowering(DAG) (20,40,60 and 80 DAG) of Hua 17,respectively.

2.3 不同萌發(fā)后時(shí)期花生子葉細(xì)胞中油體的分布

隨著種子的萌發(fā)，子葉中貯存的油脂要轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，為種子萌發(fā)和幼苗生長提供營養(yǎng)，通過分析花生種子在萌發(fā)后時(shí)期油體的動(dòng)態(tài)變化，可以看出(圖2)，在萌發(fā)后5 d時(shí)油體雖然仍充滿整個(gè)子葉細(xì)胞，但數(shù)量已明顯減少。從油體減少的速度來看，花U 606油體減少量明顯高于花17；萌發(fā)后10 d時(shí)子葉細(xì)胞內(nèi)油體的數(shù)量進(jìn)一步減少，油體間空隙變大甚至細(xì)胞中間出現(xiàn)空洞；萌發(fā)后20 d時(shí)油體數(shù)量持續(xù)減少且大多沿細(xì)胞壁分布；萌發(fā)后30 d時(shí)只有少數(shù)沿細(xì)胞邊緣分布的油體。總的來說，萌發(fā)后5 d時(shí)油體已經(jīng)開始降解，隨著萌發(fā)進(jìn)程的推進(jìn)，花U 606和花17內(nèi)油體的趨勢一致，即油體的數(shù)量都越來越少。從油體充滿細(xì)胞到逐漸分布在細(xì)胞壁的兩側(cè)，結(jié)合種子萌發(fā)后時(shí)期粗脂肪含量的變化趨勢發(fā)現(xiàn)，油體數(shù)量的變化趨勢與花生種子萌發(fā)后階段粗脂肪含量的變化趨勢一致。

其中，A,B,C,D分別代表：花U 606萌發(fā)后5 DAG,10 DAG,20 DAG,30 DAG; E,F,G,H分別代表：花17萌發(fā)后5 DAG,10 DAG,20 DAG,30 DAG。A,B,C,D stand for days after germination(DAG) ( 5, 10, 20 and 30 DAG) of Hua U 606,respectively; E，F(xiàn)，G，H days after germination(DAG) ( 5, 10, 20 and 30 DAG) of Hua 17,respectively.

2.4 不同發(fā)育時(shí)期花生子葉細(xì)胞內(nèi)油體含量的統(tǒng)計(jì)分析

為了解花生子仁在不同時(shí)期含油量與細(xì)胞內(nèi)油體含量的關(guān)系，從所得到的激光共聚焦圖片中選取子仁不同時(shí)期的切片圖片，測量細(xì)胞表面積及細(xì)胞內(nèi)油體的總截面積，計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)的油體含量(表2)。通過比較2個(gè)品種在不同時(shí)期的油體含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，油體含量越高，細(xì)胞內(nèi)含油量也越高，2個(gè)品種在種子發(fā)育時(shí)期含油量都隨著油體含量的增加而增加，花U 606中油體含量明顯高于花17，而在萌發(fā)后階段含油量則隨著油體含量的減少而減少。

表2 不同生長時(shí)期花生子葉細(xì)胞內(nèi)的含油量與油體含量Table 2 The oil content of different growth period of peanut seeds compared with the rate of the oil body g·kg-1

3 結(jié)論與討論

在油料作物種子中的貯藏物質(zhì)主要有脂類和蛋白質(zhì)，脂類物質(zhì)主要以TAG形式儲(chǔ)存在油體中。花生是中國重要的油料作物，種子中含有豐富的油脂，油脂含量能高達(dá)60%左右，因此，通過對花生子仁不同發(fā)育與萌發(fā)后時(shí)期的油體數(shù)量，形態(tài)及分布的觀察，有助于了解子仁內(nèi)油脂的動(dòng)態(tài)變化。

3.1 花生子葉細(xì)胞在不同時(shí)期油體動(dòng)態(tài)的細(xì)胞學(xué)特征變化

花生種子在油脂累積過程中，不僅有油體數(shù)量的增加，還伴隨著體積的增大，大油體通常被認(rèn)為是由小油體融合而成的，而油體是否融合則是由油體表面的油體蛋白(oleosin)決定[13-14]。占志勇[15]對油桐種仁發(fā)育的3個(gè)時(shí)期進(jìn)行研究，認(rèn)為隨著種仁發(fā)育，胚乳細(xì)胞內(nèi)的油體數(shù)量與含油量呈負(fù)相關(guān)，而油體的大小與含油量則呈正相關(guān)。在本研究中，采用徒手切片與尼羅紅染色相結(jié)合的方法，使用共聚焦顯微鏡觀察花生子仁在不同時(shí)期的油體變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著花生種子的發(fā)育，油體逐漸增多，直至充滿整個(gè)細(xì)胞且油體體積也增大，而在萌發(fā)后油體數(shù)量逐漸減少，且到萌發(fā)后30 d時(shí)油體沿著細(xì)胞壁分布。通過不同含油量在不同時(shí)期內(nèi)油體的比較發(fā)現(xiàn)，在花生子仁發(fā)育過程中花U 606和花17在油體整體變化趨勢上是一致的，只是在油體的數(shù)量及大小上有所差異。在成熟花生子仁的子葉細(xì)胞中同花17相比，高油材料花U 606油體分布更緊密，油體空隙更小，這與董勁松等[12]觀察得到的結(jié)果一致。

3.2 花生油體與油脂動(dòng)態(tài)變化過程的相關(guān)性分析

研究不同時(shí)期花生子葉細(xì)胞內(nèi)油體的動(dòng)態(tài)變化，有助于了解花生種子中油脂的積累和降解過程。本研究前期對不同發(fā)育與萌發(fā)后時(shí)期的花生子仁內(nèi)油脂含量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著種子的發(fā)育油脂的含量呈“S”型增長，即在脂質(zhì)積累初期，種子中的油脂含量緩慢增長，而在脂質(zhì)積累高峰期，種仁內(nèi)的油脂含量快速上升，而在脂質(zhì)積累后期，油脂含量趨于穩(wěn)定，在種子萌發(fā)階段種子中的油脂含量快速下降。

通過對花生子仁中子葉細(xì)胞內(nèi)的油體的截面積及油體含量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著種子的發(fā)育，油體的截面積之和增加，油體含量增加?；║ 606中油體含量明顯高于花17，而在萌發(fā)后階段，油體的截面積之和逐漸減少。分析花生子葉細(xì)胞中油脂和油體含量在不同時(shí)期的動(dòng)態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，在種子發(fā)育時(shí)期含油量隨著油體含量的增加而增加，而在萌發(fā)后階段含油量則隨著油體含量的減少而減少。

3.3 花生油體動(dòng)態(tài)相關(guān)蛋白表達(dá)變化與油脂積累過程的關(guān)聯(lián)性分析

油體的表面包裹著一層油體蛋白，油體蛋白在油脂積累與降解過程中發(fā)揮重要作用，油體蛋白與油體的形成有關(guān)，且能維持油體的穩(wěn)定。對種子發(fā)育和萌發(fā)后過程中的差異蛋白質(zhì)組學(xué)的分析可知，油體蛋白o(hù)leosin 14.9的蛋白表達(dá)豐度在種子發(fā)育階段呈“先快速增加后緩慢增加”的表達(dá)模式，這與油脂的積累模式大體一致，而在萌發(fā)后階段oleosin 14.9的蛋白表達(dá)量一直在下降，推測總油體的表面積減少。這與油體含量和油脂的降解模式一致，也進(jìn)一步說明oleosin蛋白的變化與油脂的含量有一定的相關(guān)性。

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Oilbodiesmicrostructureobservationofpeanutseedsatdifferentdevelopmentalstages

WANG Yun, LIU Ting,HE Xiaoyan, ZHANG Xingguo, MA Xingli, YIN Dongmei

(College of Agronomy , Henan Agricutural University, Zhengzhou 450002,China)

To study the relationship between the oil content and the oil bodies content, the dynamic changes of different varieties of peanut seed oil bodies (Hua U 606 and Hua 17) at different development and postgermination stages were observed by using laser scanning confocal microscopy. The results showed that the the oil bodies between the two varieties have almost the same change trend, with the only difference in the number and the size of the oil body. With the development of peanut seeds, oil bodies increased gradually and gradually concentrated in the central cell, arranged more closely. While in the post germination of the seed the number of oil bodies declined and the oil bodies arranged along the wall of the cotyledon cell in 30 DAG. Further study on the content of the oil bodies, showed that the content of the oil bodies increased in the seed development while in the seed postgermination the content of the oil bodies decreased.

peanut; laser scanning confocal microscopy; oil content; oil bodies

2017-01-26

河南省重大科技專項(xiàng)(161100111000)；河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(S2014-05-G03)

王允(1988-)，女，河南駐馬店人，博士研究生，主要從事花生的遺傳育種研究。

殷冬梅(1972-)，女，河南南陽人，教授。

1000-2340(2017)06-0775-06

S 565

A

常思敏)