假性甲狀旁腺功能減退癥患者臨床特點(diǎn)和GNAS突變分析

吳云芳，劉靖芳，湯旭磊，楊曉梅

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000)

假性甲狀旁腺功能減退癥患者臨床特點(diǎn)和GNAS突變分析

吳云芳，劉靖芳*，湯旭磊，楊曉梅

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000)

假性甲狀旁腺功能減退癥(pseudohypoparathyroidism，PHP)是一種以靶器官(骨、腎臟)對甲狀旁腺激素(parathy-roid hormone，PTH)抵抗為特征，臨床上以低鈣血癥、高磷血癥和血液循環(huán)中PTH增加為主要臨床表現(xiàn)的家族遺傳性疾病。部分患者具有多種先天性生長和骨骼發(fā)育缺陷：如身材矮小、圓臉、肥胖、短頸、指(趾)粗短、異位鈣化灶、甚至智力發(fā)育障礙等。研究顯示PHP發(fā)病與G蛋白α基團(tuán)(GNAS)突變有關(guān)[1]。本文對蘭州大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的一例PHP患者及其父母的臨床特點(diǎn)和GNAS突變進(jìn)行分析，從分子水平了解該病的發(fā)病機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 臨床資料：患者女性，7歲，因“間斷四肢抽搐2年，發(fā)現(xiàn)血鈣降低5 d”收住院?；颊哂谌朐呵?年開始每于情緒緊張時反復(fù)出現(xiàn)四肢抽搐，每次發(fā)作持續(xù)時間不定，均可自行緩解，發(fā)作時意識清楚，伴頭痛、惡心，偶有嘔吐，嘔吐物為胃內(nèi)容物，無頭暈、耳鳴及視物旋轉(zhuǎn)等不適?；颊咦阍马槷a(chǎn)，無窒息及缺血缺氧史，生長發(fā)育過程中智力及體型均正常。查體： 身高125 cm， 體質(zhì)量25 kg。發(fā)育正常， 神志清楚，圓臉，全身無浮腫，甲狀腺無腫大，四肢無畸形，肌力及肌張力均正常，Trousseou征陽性，智 商測試評分75 分(中等智力)。實(shí)驗(yàn)室檢查：血鈣1.65 mmol/L(正常值2.10～2.80 mmo/L)，血磷2.77 mmol/L(0.97～1.60 mmol/L)。堿性磷酸酶350.0 U/L(20～125 U/L)，骨特異性堿性磷酸酶125.50 μg/L(4.6～14.3 μg/L)，25-羥-維生素D 42.93 nmol/L(47.7～144 nmol/L)，PTH 1347.0 pg/mL(16～87 pg/mL)。尿鈣0.2 mmol/24 h(2.5～7.5 mmol/24 h)，尿磷8 mmol/24 h(23～48 mmol/24 h)。肝腎功及甲狀腺功能檢查均正常。跟骨骨密度檢查：左腳T值-1.2。雙手正位片示：骨小梁稀疏，干骺段膨大，考慮輕度脫鈣表現(xiàn)(圖1)。頭顱X線片未見明顯異常。

1.1.2 家系資料：患者父母智力、身高及體質(zhì)量均正常，體型正常。家族中無類似發(fā)病史。家系中成員無近親婚配史。

1.1.3 主要試劑：100 bp DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、DNA提取試劑、Tap DNA聚合酶及PCR擴(kuò)增試劑(上海生工公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提?。喝』颊呒捌涓改竿庵莒o脈血各5 mL，EDTA抗凝，提取外周血白細(xì)胞DNA，-20 ℃冰箱保存。

A.hands anteroposterior radiograph；B.hands oblique radiograph圖1雙手正斜位片F(xiàn)ig 1 Hands anteroposterior and oblique radiographs

1.2.2 PCR擴(kuò)增GNAS第1-13號外顯子： PCR擴(kuò)增患者及其父母GNAS第1-13號外顯子，根據(jù)GNAS序列，使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)對1-13外顯子的特異性引物(表1)。按照下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：基因組DNA 1 μL，dNTP 0.5 μL，Tap聚合酶0.2 μL，Tap緩沖液2.5 μL，引物各0.5 μL，加水20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～60 s，循環(huán)35次，最后72 ℃修復(fù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化和測序：PCR產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司，在3730XL自動測序儀上進(jìn)行測序。用SepMan軟件將獲得的序列與GenBank所提供的外顯子序列進(jìn)行對比，以確定突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果

DNA測序顯示，該患者GNAS第5外顯子393位核苷酸發(fā)生C→T，該定義為同義突變，其所編碼的131位氨基酸仍為異亮氨酸，該改變考慮為SNP位點(diǎn)：c.393C>T(p.I131I)。其父親和母親GNAS未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)(圖2)。

3 討論

本例患者出生后第5年開始間斷性出現(xiàn)四肢抽搐及下頜抖動，多于情緒緊張時誘發(fā)，實(shí)驗(yàn)室檢查提示低血鈣、高血磷、低尿鈣、低尿磷、高PTH血癥，伴有血堿性磷酸酶升高，故PHP診斷明確。

本研究中對患者及其父母進(jìn)行GNAS突變檢測，僅發(fā)現(xiàn)1個SNP位點(diǎn)，位于第5外顯子(c.393C>T)，國內(nèi)亦有類似文獻(xiàn)報(bào)道，所發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)分別位于：第二內(nèi)含子33位堿基G/A，第5外顯子81位堿基C/T，第13號外顯子293位堿基G/A，第2號外顯子c.212A>C(p.E71D)，第5外顯子c.393C>T(p.I131I)[2]?？紤]國內(nèi)散發(fā)性PHP患者對該疾病的易感性可能與GNASSNP位點(diǎn)相關(guān)。本研究中該P(yáng)HP患者GNAS1-13外顯子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)有意義的突義的突變，考慮可能與以下因素有關(guān)：1)突變存在于GNAS的其他區(qū)域，如啟動子區(qū)、調(diào)控序列或內(nèi)含子區(qū)；也可能發(fā)生GNAS亞微觀缺失或甲基化缺失[3]。2)可能存在除GNAS以外的其他基因突變，如PRKAR1A、PDE4D等基因突變[3]，具體的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

表1 擴(kuò)增GNAS第1-13號外顯子的引物序列Table 1 Primer Sequences of GNAS 1-13 exons

A.patient; B.mother; C.father圖2 GNAS第5外顯子測序結(jié)果Fig 2 Sequencing of PCR product of GNAS in exon 5

[1] Mantovani G, Spada A, Elli FM.Pseudohypoparathyroidism and Gsα-cAMP-linked disorders:current view and open issues[J].Nat Rev Endocrinol,2016,12:347- 356.

[2] 陳燕燕，孫曉芳，袁鷹.假性甲狀旁腺功能減退癥Ⅰa型臨床與基因分析[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2014，8：576- 580.

[3] Elli FM, DeSanctis L, Ceoloni B,etal.Pseudohypoparathyroidism type Ia and pseudo-pseudohypoparathyroidism: the growing spectrum of GNAS inactivating mutations[J].Hum Mutat,2013,34:411- 416.

2016- 12- 19

2017- 03- 23

*通信作者(correspondingauthor)：ljf824168@126.com

1001-6325(2018)01-0095-03

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