腫瘤患者血小板對肝癌細胞系Bel- 7402增殖和多藥耐藥蛋白ABCC4的影響

周雅君，時 菁，肖 亮，田 耕，周漢新，高國全

(1.中山大學 中山醫(yī)學院，廣東 廣州 510000； 2.深圳市第二人民醫(yī)院 中心實驗室， 廣東 深圳 518000)

腫瘤患者血小板對肝癌細胞系Bel- 7402增殖和多藥耐藥蛋白ABCC4的影響

周雅君1,2，時 菁2，肖 亮2，田 耕2，周漢新2，高國全1*

(1.中山大學 中山醫(yī)學院，廣東 廣州 510000； 2.深圳市第二人民醫(yī)院 中心實驗室， 廣東 深圳 518000)

血小板與炎性反應(yīng)的發(fā)展，腫瘤的血管生成、腫瘤的轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[1]。多藥耐藥相關(guān)蛋白4(multidrug resistance-asscociated protein 4, ABCC4，MRP4)，是一種ABC(ATP-binding cassette trasporter)轉(zhuǎn)運蛋白。ABCC4的高表達與腫瘤細胞的增長和惡性程度密切相關(guān)[2]，但腫瘤患者血小板與ABCC4的相關(guān)性尚不清楚，本文擬探討腫瘤患者的血小板對腫瘤細胞增殖和ABCC4表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血小板來源：隨機選取三名正常健康人(control)、40～60歲男或女性未化療(NCP)(肺癌、乳腺癌)和化療(CP)(肺癌、子宮內(nèi)膜癌，不論化療療程，化療1年內(nèi))的腫瘤患者抽血制血小板(該研究已獲得本單位倫理委員會的批準及受試者簽署的知情同意書)。

1.1.2 細胞系：人肝癌細胞Bel- 7402(中科院上海細胞庫)

1.1.3 藥物與試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone公司)；CCK- 8試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；兔抗人ABCC4單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)；ECL化學發(fā)光顯色試劑盒(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下，10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人肝癌細胞Bel- 7402，觀察細胞增殖情況，每2 d傳代1次，取對數(shù)期細胞用于實驗。

1.2.2 血小板提取方法：0.38 %的枸櫞酸鈉抗凝管采血，Tyrode緩沖液稀釋后200×g離心，取上層液體1 000×g離心，制成3.0×108個/mL的洗滌血小板，備用。

1.2.3 CCK- 8檢測細胞增殖：對數(shù)期細胞Bel- 7402接種至96孔板(4×103個/孔)，細胞貼壁后加入3.0×107個/孔的正常健康人群血小板(normal people platelet, NPP)、未化療腫瘤患者血小板(no chemotherapy patient platelet, NCP)和化療的腫瘤患者血小板(chemotherapy patient platelet, CP)，分別孵育24和48 h，棄血小板后加入10 μL CCK- 8反應(yīng)液，孵育1 h，酶標儀測定各組在450 nm處吸光度值(A450)。

1.2.4 Western blot檢測ABCC4蛋白的表達：對數(shù)期細胞Bel- 7402接種至6孔板(106個/孔)，細胞貼壁后加入NPP、NCP和CP(3.0×108個/mL)，共孵育24 h，棄血小板，孔內(nèi)細胞裂解，制蛋白樣品。BCA法測定蛋白濃度。30 ng/孔蛋白樣品上樣，分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育、顯色、分析。

2 結(jié)果

2.1 正常健康人、未化療和化療患者組對Bel- 7402細胞增殖的影響：無論化療與否，腫瘤患者血小板均能促進Bel- 7402細胞的增殖(P<0.001)(圖1)。

*P<0.001 compared with control and NPP圖1 不同人群血小板對Bel- 7402細胞增殖的影響Fig 1 Effect of the platelet on proliferation of

2.2 不同患者人群血小板同Bel- 7402孵育后對ABCC4蛋白表達的影響:CP組ABCC4的表達較NPP和NCP組的血小板顯著增加(P<0.05)(圖2A)。無論是否經(jīng)歷過化療，腫瘤患者的血小板均可使腫瘤細胞ABCC4的表達增高(P<0.05)(圖2B)。

A.expression of ABCC4 in different populations; B.expression of ABCC4 in Bel- 7402;*P<0.05 compared with control and normal people group

3 討論

腫瘤細胞與血小板之間相互作用是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[3]。ABCC4是新近關(guān)注較多的多藥耐藥相關(guān)蛋白，研究表明其對腫瘤細胞的增殖具有重要作用[4]。本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血小板促人肝癌Bel- 7402細胞增殖，其機制可能與血小板釋放某些促腫瘤細胞增殖的因子相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)化療腫瘤患者血小板ABCC4表達增加，而未化療腫瘤患者同正常健康人血小板ABCC4蛋白表達無差異，為血小板與腫瘤多藥耐藥相關(guān)性提供了新的切入點。另外，實驗研究發(fā)現(xiàn)人肝癌Bel- 7402細胞ABCC4蛋白表達增多，提示人肝癌Bel- 7402細胞ABCC4蛋白表達同肝癌細胞的增殖具有相關(guān)性。

[1] Leslie M. Cell biology. Beyond clotting: the powers of platelets[J]. Science, 2010, 328: 562- 564.

[2] Fletcher JI, Haber M, Henderson MJ,etal. ABC transporters in cancer: more than just drug efflux pumps[J]. Nat Rev Cancer, 2010, 10: 147- 156.

[3] Jain S, Harris J, Ware J. Platelets: linking hemostasis and cancer[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010, 30: 2362- 2367.

[4] Zhao X, Guo Y, Yue W,etal. ABCC4 is required for cell proliferation and tumorigenesis in non-small cell lung cancer[J]. Onco Targets Ther, 2014, 7: 343- 351.

2016- 10- 31

2017- 03- 21

深圳市科技計劃項目(JCYJ20140414170821259)；深圳細胞生物技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室(2DSY20130531165409949)

*通信作者(correspondingauthor)：gaog91@foxmail.com

1001-6325(2018)01-0093-02

R730.6

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