慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織中肺表面活性物質(zhì)蛋白-C表達下降

張 偉，王煜霞，朱認真，姬明麗

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

研究論文

慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織中肺表面活性物質(zhì)蛋白-C表達下降

張 偉，王煜霞，朱認真，姬明麗*

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的探討肺表面活性物質(zhì)蛋白-C(SP-C)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺組織中的作用。方法將大鼠隨機分為對照組、香煙煙霧暴露組、脂多糖組和COPD組，每組10只。測定各組大鼠的PaO2和PaCO2的水平；透射電鏡觀察肺組織的細胞微觀結(jié)構(gòu)；ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺組織SP-C蛋白；RT-qPCR檢測肺組織SP-C mRNA的表達。結(jié)果與其他組相比，COPD大鼠的PaO2最低，而PaCO2最高；肺泡Ⅱ型上皮細胞表面微絨毛明顯減少(P<0.01)；BALF和肺組織中SP-C蛋白表達下降(P<0.01)；肺組織中的SP-C mRNA表達下降(P<0.01)。結(jié)論SP-C在COPD大鼠肺組織中表達下調(diào)，這種下調(diào)可能引起肺通氣和肺換氣功能障礙。

慢性阻塞性肺疾?。槐砻婊钚晕镔|(zhì)蛋白-C；呼吸功能

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，其發(fā)生與慢性氣道炎性反應增強有關(guān)，是以持續(xù)進行性氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)疾病，患者可表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、喘息及滯痰等[1- 2]。炎性反應、吸入氣中的顆粒物質(zhì)及有害成分是已經(jīng)明確的危險因素，目前研究較多的是香煙煙霧和炎性刺激在慢阻肺發(fā)病機制中的作用[3- 4]。肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)由約90%磷脂和約10%蛋白質(zhì)組成，位于肺泡上皮細胞表面[5]。PS可降低肺泡表面張力、抑制炎性反應、結(jié)合和破壞氣道上的微生物，通過肺泡巨噬細胞以及與內(nèi)源性和外源性分子結(jié)合增加吞噬作用[5]。肺表面活性物質(zhì)蛋白C(surfactant protein C，SP-C)是肺表面活性蛋白之一，對髓磷脂合成和表面活性物質(zhì)形成不可缺少，在肺表面活性物質(zhì)的功能發(fā)揮起著關(guān)鍵作用[6]。因此，本研究采用香煙煙霧暴露及脂多糖氣管內(nèi)滴注方法構(gòu)建的COPD模型為實驗對象，探討SP-C改變對呼吸功能的影響及機制，以期為慢阻肺的臨床防治提供可行的思路與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

香煙為紅旗渠牌過濾嘴香煙(每支含焦油量12 mg、尼古丁0.9 mg、CO 15 mg，由河南中煙工業(yè)有限公司出品)；LPS(Sigma公司)；4%水合氯醛(上海蕓強化工有限公司)；SP-C酶聯(lián)檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Trizol、SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)；SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒(TaKaRa公司)；引物合成由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組：CV(conventional，CV)級SD大鼠40只 [鄭州大學實驗動物中心；合格證號：Scxk(豫)2010- 0002] 隨機分為4組，對照組；香煙煙霧暴露組(煙霧組)：每日煙霧暴露2次，每次30 min，持續(xù)暴露28 d；脂多糖組：第1和第14天以1 mg/kg的劑量氣管內(nèi)滴注脂多糖；慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組(慢阻肺組)：每日煙霧暴露2次，每次30 min，持續(xù)28 d，在第1和第14天氣管內(nèi)滴注脂多糖，每次滴注劑量1 mg/kg。第29天，收集動脈血3 mL、支氣管肺泡灌洗液5 mL及取出右肺下葉肺組織。

1.2.2 超微結(jié)構(gòu)觀察: 肺組織常規(guī)制片,置于透射電鏡下觀察肺泡上皮細胞的變化。

1.2.3 檢測PaO2和PaCO2:用M248全自動血氣分析儀測大鼠動脈血PaO2和PaCO2值。

1.2.4 ELISA檢測肺組織和肺泡灌洗液中SP-C含量:按照相應試劑盒要求操作，樣品均做復孔，以DG5031酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450 nm吸光度值并計算相應蛋白質(zhì)濃度。

1.2.5 實時熒光定量PCR法檢測肺組織SP-C mRNA的表達:以總RNA為模板，利用SuperScript Ⅲ reverse transcriptase合成cDNA，RT-qPCR按照SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒的說明操作。SP-C上游引物序列為5′-GAAACTCAGAA ACGCCTCG-3′，下游引物序列為5′-CCCAGAAGAA TCAGAATCGG-3′， 長度285 bp；內(nèi)參β-actin的上游引物序列為 5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′，下游引物序列為5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′，擴增片段長度為110 bp。采用的RT-qPCR程序如下：95 ℃ 5 min進行預變性；95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)。反應在ABI 7300熒光定量PCR儀上進行，設(shè)cDNA樣品3次重復。利用2-△△Ct相對定量法計算相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)

慢阻肺組大鼠的肺泡Ⅱ型上皮細胞表面微絨毛明顯減少、板層小體空泡化、線粒體可見腫脹或伴有嵴缺如。煙霧組大鼠的肺泡Ⅱ型上皮細胞表面微絨毛減少、部分板層小體有空泡現(xiàn)象，線粒體形態(tài)基本正常、線粒體嵴可見腫脹斷裂。脂多糖組大鼠Ⅱ型上皮細胞表面微絨毛基本正常、板層小體未見空泡現(xiàn)象，線粒體形態(tài)基本正常、線粒體嵴可見腫脹。對照組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞板層小體結(jié)構(gòu)和線粒體結(jié)構(gòu)未見異常，細胞完整、表面微絨毛正常(圖1)。

圖1 大鼠肺組織細胞透射電鏡超微結(jié)構(gòu)Fig 1 Ultrastructure of lung tissues (transmission electron microscopy, ×7000)

2.2 大鼠PaO2和PaCO2

COPD組、煙霧組和脂多糖組大鼠PaO2均低于對照組大鼠，而3個實驗組大鼠的PaCO2均高于對照組。COPD組大鼠PaO2低于煙霧組和脂多糖組(P<0.01)(圖2)。COPD組大鼠PaCO2與煙霧組和脂多糖組相比，明顯升高(P<0.01)(圖2)。

*P<0.01 compared with control; △P<0.01 compared with LPS;#P<0.01 compared with smoke圖2 大鼠PaO2和PaCO2的各組比較Fig 2 Comparison of PaO2 and PaCO2

2.3 大鼠支氣管肺泡灌洗液和肺組織中SP-C含量

COPD、煙霧組和脂多糖組大鼠BALF和肺組織中SP-C的含量均低于對照組(P<0.01)，而COPD組大鼠BALF和肺組織中SP-C的含量又低于煙霧組與脂多糖組(P<0.01)(圖3)。

*P<0.01 compared with control; △P<0.01 compared with LPS;#P<0.01 compared with smoke圖3 大鼠支氣管肺泡灌洗液和肺組織中SP-C含量Fig 3 Content of SP-C in BALF and lung tissues

2.4 大鼠肺組織SP-C mRNA水平

與對照組相比，3個實驗組大鼠肺組織中SP-C mRNA的表達水平均下調(diào)(P<0.01)。在所有實驗組中，COPD組中SP-C的表達量最低，低于煙霧組和脂多糖組(P<0.01)(圖4)。

*P<0.01 compared with control; △P<0.01 compared with LPS;#P<0.01 compared with smoke圖4 大鼠肺組織中的SP-C mRNA水平比較Fig 4 Change of SP-C mRNA expression in lung

3 討論

吸煙是引起COPD的主要致病因素。香煙煙霧中含有的丙烯醛等成分會導致呼吸道的防御及凈化功能的降低，大大增加呼吸道對細菌的易感性，從而導致支氣管及肺的損傷[7]。LPS通過內(nèi)毒素途徑激活巨噬細胞等相關(guān)細胞，導致肺內(nèi)中性粒細胞的產(chǎn)生，觸發(fā)炎性反應[8]。因此，用熏香煙加氣管內(nèi)注入內(nèi)毒素的方法建立大鼠COPD模型，探討SP-C蛋白在慢阻肺病程中的作用。

SP-C蛋白是表面活性物質(zhì)的重要組成成分，主要功能是維持肺泡表面脂類物質(zhì)活性，降低肺泡表面張力，維持肺泡順應性，維持肺泡通氣功能[5,9]。生理條件下，SP-C使氣血交換加速并促進Ⅱ型肺泡上皮細胞對磷脂的攝取轉(zhuǎn)化。病理條件下，可以減弱血漿蛋白對PS的抑制作用、減輕水腫液對PS的抑制作用、減輕病理因素對肺泡順應性的損傷作用、穩(wěn)定呼吸膜的生理活性和功能[10- 12]。在本研究中，慢阻肺組大鼠無論是在支氣管肺泡灌洗液中還是肺組織中，SP-C含量是3個實驗組中最低的，與之對應的是在各組大鼠肺組織SP-C mRNA水平的比較結(jié)果同樣顯示COPD組的水平最低，這與在COPD組大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞超微結(jié)構(gòu)損傷最嚴重的結(jié)果一致。Ⅱ型肺泡上皮細胞結(jié)構(gòu)的破壞會引起肺泡完整性的破壞和順應性下降。SP-C表達下降使表面活性物質(zhì)磷脂層不穩(wěn)定。肺泡表面形成的氣相-液相交換界面不穩(wěn)定，不利于氣血交換，并使肺換氣功能下降及肺泡通氣量減少。

綜上所述，COPD大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞結(jié)構(gòu)損傷，使得SP-C表達下降，導致肺泡表面活性物質(zhì)減少和肺泡氣血交換膜損傷引起肺泡順應性下降肺泡通氣量減少肺通氣功能障礙及氣血交換障礙肺換氣功能障礙等。因此，本研究認為SP-C表達下降是COPD大鼠肺通氣和肺換氣功能障礙的重要原因之一，也是導致COPD大鼠中低PaO2和高PaCO2的直接原因。

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Decreased expression of surfactant protein C in lung tissue of chronic obstructive pulmonary disease rats

ZHANG Wei, WANG Yu-xia, ZHU Ren-zhen, JI Ming-li*

(School of Basic Medical Sciences, Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003, China)

ObjectiveTo study the role of surfactant protein C (SP-C) in rat lung of chronic obstructive pulmonary disease (COPD).MethodsForty healthy conventional Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups, normal control group (control group), smoke exposure group (smoking group), lipopolysaccharide group (LPS group), smoke exposure + Lipopolysaccharide group (COPD group). The arterial partial pressure oxygen (PaO2) and arterial partial pressure of carbon dioxide pathological (PaCO2) were detected. The ultrastructure of lung tissue was observed by transmission electron microscope. Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) were performed to determine protein expression of SP-C in lung and bronchoalveolar lavage fluid (BALF). RT-qPCR were performed to determine mRNA expression of SP-C in lung.ResultsCompared with control group, smoking group and LPS group, the PaO2of COPD group was obviously lower, the PaCO2of COPD group was obviously higher; the ultrastructure and histological analysis of lung tissues showed chronic inflammatory injury; Compared with control group, the expression of SP-C protein in was reduced, as well as SP-C mRNA expression.ConclusionsThe expression of SP-C in lung of rats COPD model is down-regulated. SP-C may be involved in COPD.

chronic obstructive pulmonary disease; surfactant protein C; respiratory function

2016- 11- 08

2017- 03- 27

河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃(132300410160)；河南省科技廳科技攻關(guān)研究計劃(162102310121)；新鄉(xiāng)醫(yī)學院高學歷人才啟動基金(505001)

*通信作者(correspondingauthor)：teachermingliji@163.com

1001-6325(2018)01-0047-04

R994.6

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