高脂飲食通過p-AMPK/mTOR信號通路下調(diào)小鼠肝細胞自噬水平

徐 玲，馬紅艷，楊 軍，高陳林

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝科， 四川 瀘州 646000)

研究論文

高脂飲食通過p-AMPK/mTOR信號通路下調(diào)小鼠肝細胞自噬水平

徐 玲*，馬紅艷，楊 軍，高陳林

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝科， 四川 瀘州 646000)

目的探討高脂飲食對小鼠肝細胞自噬的影響并分析其可能機制。方法將C57BL小鼠隨機分為2組，每組n=15，給予常規(guī)飲食(NC)或高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)，8、12和16周后每組隨機處死5只小鼠，測體質(zhì)量、肝質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量；油紅(Oil-Red-O)染色測肝脂質(zhì)沉積；Western blot檢測肝臟自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和自噬調(diào)控信號通路蛋白p-mTOR和p-AMPK的表達。結(jié)果8周時，HFD組小鼠出現(xiàn)腹型肥胖，16周時小鼠體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量及肝脂滴沉積較NC組明顯增加(P<0.01)；HFD組8周時肝臟LC3Ⅱ表達較NC組增加(P<0.05)；而12及16周肝臟LC3Ⅱ表達較NC組顯著降低(P<0.05)；P62表達較NC組明顯增加(P<0.05)。與NC組相比，HFD組各時間點肝臟p-AMPK表達均減少，而p-mTOR蛋白表達均顯著增加。結(jié)論高脂飲食初期小鼠肝細胞自噬短暫增加，但長期高脂飲食可導致肝細胞自噬水平顯著下調(diào)甚至衰竭，肝細胞自噬水平下調(diào)與高脂飲食抑制肝細胞p-AMPK表達及增加p-mTOR的活性有關(guān)。

自噬；肝細胞；高脂飲食

自噬(autophagy)是通過細胞內(nèi)的溶酶體途徑，降解和再利用自身衰老和功能異常的細胞器、損壞的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等細胞質(zhì)內(nèi)成分的過程，是細胞進行自我保護的一種重要機制[1]。研究發(fā)現(xiàn)肝細胞自噬與脂肪肝、2 型糖尿病和肥胖等代謝性疾病密切相關(guān)[2- 3]。但關(guān)于肝細胞自噬與肥胖和脂肪肝等代謝性疾病的相互作用不完全清楚且存在爭議。有報道[4]高脂飲食導致肝細胞自噬明顯降低；也有報道[5]高脂飲食早期并沒有引起肝細胞自噬的改變。就其原因可能與實驗?zāi)Ｐ图坝^察時間差異有關(guān)。

mTOR (mammalian target of rapamycin, mTOR)蛋白是自噬發(fā)生的主要抑制蛋白，AMPK(AMP-activated protein kinase,AMPK)作為一種細胞能量敏感因子，參與mTOR信號通路調(diào)節(jié)細胞自噬[6]。據(jù)此，本研究采用不同飲食喂養(yǎng)小鼠，分不同時間點觀察高脂飲食對肝細胞自噬以及AMPK/mTOR信號通路的影響，探討高脂飲食對肥胖小鼠肝細胞自噬的影響和可能作用機制，為今后高脂誘導的肥胖和脂肪肝等代謝性疾病的防治提供新的方向及靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級8周齡體質(zhì)量為20～23 g的C57BL 雄性小鼠[西南醫(yī)科大學動物實驗室提供，SCXK(川)2013- 17]。

1.1.2 實驗材料：總蛋白抽提試劑盒(Chemicon公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)；ECL Plus化學發(fā)光試劑盒(Amersham公司)；兔抗小鼠單克隆抗體p-mTOR、p-AMPK(Cell Signal公司)；兔抗小鼠單克隆抗體β-acting、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和油紅O(Sigma公司)；兔抗小鼠單克隆抗體P62/SQSTM1(MBL公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組：將小鼠分為對照組(control, NC)(16%脂肪)和高脂飲食組(high fat die, HFD)(52%脂肪)，每組15只，自由進食及飲水，每周測體質(zhì)量及進食量，喂養(yǎng)8、12和16周測體質(zhì)量后，兩組分別隨機處死5只小鼠，測內(nèi)臟脂肪(腸系膜和附睪脂肪組織)和肝臟質(zhì)量。

1.2.2 Oil-Red-O染色測肝細胞脂質(zhì)沉積：取肝組織，OCT包埋并冰凍切片(8 μm)，10%甲醛固定，60%異丙醇處理后行油紅稀釋液染色20 min，70%甘油封片，顯微鏡觀察肝細胞中脂質(zhì)的沉積。

1.2.3 Western blot檢測測肝細胞中p-AMPK、p-mTOR、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62蛋白的表達：取肝臟組織，裂解液裂解，提取細胞總蛋白，用BCA法測蛋白含量。5%～15 %的SDS-PAGE 電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,脫脂牛奶封閉,分別加入兔抗p-mTOR、p-AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62/SQSTM1、β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，再經(jīng)HRP 標記的二抗室溫反應(yīng)1 h，化學發(fā)光顯影，Bio-rad紫外凝膠成像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描。結(jié)果以p-mTOR、p-AMPK、P62與β-actin INT值的比值及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ INT值的比值進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪及肝臟質(zhì)量的比較

各小鼠生長良好，對照組(control)小鼠每天進食熱量(10.64±1.15)kcal，高脂組(HFD)小鼠每天進食熱量(10.55±1.42)kcal。

8周時高脂飲食組小鼠內(nèi)臟脂肪顯著增加(P<0.01)，16周時高脂組小鼠體質(zhì)量和內(nèi)臟脂肪較對照組增加更為明顯(P<0.01)(表1)。

2.2 各組小鼠肝細胞脂質(zhì)沉積的比較

與對照組比較， 高脂飲食喂養(yǎng)8周，小鼠肝細胞已經(jīng)出現(xiàn)脂質(zhì)沉積，但脂滴較小，隨著高脂飲食喂養(yǎng)時間延長，高脂飲食組小鼠肝泡沫細胞增多，脂質(zhì)沉積明顯增多，脂滴明顯增大(圖1)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪及肝臟質(zhì)量比較Table 1 Body weight,intra abdominal fat and liver weight of each group of mice(±s,g, n=5)

*P<0.05 compared with control group.

2.3 各組小鼠肝細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62蛋白表達的比較

與對照組相比，高脂組8周時小鼠肝臟LC3Ⅱ表達稍增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加(P<0.05)。12及16周時，高脂組肝臟LC3Ⅱ表達較對照組明顯減少，而P62蛋白明顯增加(圖2)。

2.4 各組小鼠肝臟p-mTOR、p-AMPK蛋白表達的比較

與對照組相比，HFD組8周時小鼠肝臟p-AMPK表達稍減少，12、16周時p-AMPK蛋白減少更明顯，呈時間依賴性。與之相反，高脂組8、12和16周時小鼠肝臟p-mTOR蛋白表達較對照組顯著增加(圖3)。

3 討論

自噬廣泛存在于真核細胞中，涉及細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)降解及重復(fù)利用，是細胞進行自我保護的一種重要機制。在自噬過程中，微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3, LC3)是自噬體的標志分子，LC3Ⅱ的表達強度及LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ比值與自噬呈正相關(guān)。P62是細胞自噬的經(jīng)典底物，P62增多表明自噬對細胞內(nèi)錯誤折疊或損傷的蛋白降解能力下降或失能。肝細胞自噬功能受損會阻礙肝內(nèi)脂滴的降解導致肝細胞脂肪沉積。故檢測細胞LC3Ⅱ、 P62表達和肝脂滴沉積情況可作為自噬水平的監(jiān)測[7]。

*P<0.05 compared with control group圖2 各組小鼠肝細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62蛋白的表達Fig 2 Expression of hepatic LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and P62 protein among groups of mice(±s, n=5)

*P<0.05 compared with control group圖3 各組小鼠肝臟p-mTOR、p-AMPK蛋白的表達Fig 3 Expression of hepatic p-mTOR and p-AMPK protein among groups of mice(±s, n=5)

有報道認為[4,8]肥胖糖尿病大鼠及高脂飲食導致小鼠肝自噬水平降低，胃旁路手術(shù)后可顯著提高肝自噬，降低肝脂質(zhì)沉積；但也有[5]報道認為在7周時高脂飲食并沒有引起肝細胞自噬水平的改變。本研究中兩組小鼠進食熱量一致，但飲食結(jié)構(gòu)不同導致高脂組在8周已出現(xiàn)內(nèi)臟肥胖，同時肝細胞LC3Ⅱ表達稍增加，提示在高脂誘導肥胖小鼠初期，肝細胞自噬沒有被抑制，甚至有短暫的上調(diào)。12、16周高脂飲食小鼠肝臟脂滴增多增大，LC3Ⅱ表達下降，P62明顯增多，均提示肝細胞內(nèi)自噬下調(diào)甚至衰竭。本研究結(jié)果與報道[5,9]高脂作用初期，胰島β細胞自噬水平增強，隨著高脂作用時間延長，細胞自噬下調(diào)甚至衰竭相一致。這可能是肥胖早期機體為適應(yīng)環(huán)境改變啟動自我保護機制，但隨著肥胖的加重，這種自我保護機制很快被破壞。

自噬眾多的信號調(diào)節(jié)通路中mTOR蛋白是自噬發(fā)生的主要抑制蛋白，p-AMPK可抑制mTOR活性從而活化自噬[6]。本研究結(jié)果表明高脂飲食小鼠肝臟自噬水平下調(diào)與p-AMPK/mTOR信號通路密切相關(guān)，與新近報道[10]一致。本研究同時發(fā)現(xiàn)高脂飲食8周時肝細胞自噬水平有短暫上調(diào)，與p-AMPK降低，p-mTOR表達增加相矛盾，提示高脂誘導的肥胖早期，小鼠肝細胞自噬短暫輕度上調(diào)可能與p-AMPK/mTOR信號通路之外的其他通路有關(guān)，具體調(diào)節(jié)機制還有待于進一步研究。

綜上所述，小鼠肝細胞自噬在高脂飲食作用下呈動態(tài)改變，在高脂飲食初期肝細胞自噬水平短暫輕度增加，但長期高脂飲食可導致肝細胞自噬水平顯著下調(diào)甚至衰竭，肝細胞自噬水平下調(diào)與高脂飲食抑制肝細胞p-AMPK表達及增加p-mTOR的活性有關(guān)。

[1] Kim KH， Lee MS. Autophagy-a key player in cellular and body metabolism[J]. Nat Rev Endocrinol, 2014，10：322- 337.

[2] Madrigal-Matute J，Cuervo AM. Regulation of liver metabolism by autophagy[J]. Gastroenterology, 2016，150：328- 339.

[3] 翁俊華,李娟,徐江海.自噬在肝臟疾病中的作用[J].基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床，2014，34：559- 561.

[4] Zeng TS，Liu FM，Zhou J，etal. Depletion of Kupffer cells attenuates systemic insulin resistance, inflammation and improves liver autophagy in high-fat diet fed mice[J]. Endocr J，2015，62：615- 626.

[5] Yang L，Li P，F(xiàn)u S，etal. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance[J].Cell Metab，2010，11：467- 478.

[6] Perl A. mTOR activation is a biomarker and a central pathway to autoimmune disorders, cancer, obesity, and aging[J]. Ann N Y Acad Sci，2015，346：33- 44.

[7] Martinez-Lopez N， Singh R. Autophagy and lipid droplets in the liver [J]. Annu Rev Nutr，2015，35：215- 237.

[8] He B，Liu L，Yu C，etal. Roux-en-Y gastric bypass reduces lipid overaccumulation in liver by upregulating hepatic autophagy in obese diabetic rats[J]. Obes Surg，2015， 25：109- 118.

[9] Mazza S，Maffucci T. Autophagy and pancreatic β-cells[J].Vitam Horm，2014，95：145- 164.

[10] Schloesser A，Campbell G，Gluer CC，etal. Restriction on an energy-dense diet improves markers of metabolic health and cellular aging in mice through decreasing hepatic mTOR activity[J]. Rejuvenation Res，2015，18：30- 39.

High-fat diet suppresses hepatic autophagyviap-AMPK/mTOR signal channel in mice

XU Ling*, MA Hong-yan, YANG Jun, GAO Chen-lin

(Dept. of Endocrinology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, China)

ObjectiveTo investigate the effects of high fat diet on hepatic autophagy in mice and analyze the possible mechanism.MethodsC57BL male mice were fed with either normal diet or high-fat diet (HFD) for 8,12 or 16 weeks.The mice were sacrificed after measuring the body weight. The mesentery and epididymal fat tissue weight，the liver weight and the hepatic lipid accumulation were detected. The expression of hepatic AMP-activated protein kinase (AMPK) and mammalian target of rapamycin (mTOR) protein and autophagic markers including LC3Ⅱ, P62 protein were measured by Western blot.ResultsHFD-fed mice displayed significantly heavier body weight at 16 weeks and significantly heavier intra abdominal fat weight and lipid overaccumulation in liver at 8,12,16weeks(allP<0.01). Western blot showed hepatic LC3Ⅱ expression was up-regulated mildly in HFD fed mice at 8 weeks(P<0.05), but the change dramatically was reversed, hepatic LC3Ⅱ was significantly lower in HFD fed mice at 12,16 weeks, as well as P62 was increased in HFD fed animals(allP<0.05). HFD suppressed phos-phorylation of AMPK and increased phosphorylation of mTOR levels in liver at 8,12,16 weeks, compared to the normal-diet fed mice.ConclusionsOur data demonstrate that hepatic autophagy is in dynamic change in high-fat diet mice, long term high-fat diet severely suppressed hepatic autophagy, which is associated with decreased p-AMPK and increased p-mTOR.

autophagy; hepatic cell; high fat diet

2016- 12- 15

2017- 03- 23

四川省衛(wèi)生廳科研項目(120330)

*通信作者(correspondingauthor)：houyf123@126.com

1001-6325(2018)01-0037-05

R363.2

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