新發(fā)睪丸決定基因SRY突變導(dǎo)致46,XY性發(fā)育異常三例

王 曦，聶 敏，劉兆祥，茅江峰，伍學(xué)焱

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 協(xié)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 內(nèi)分泌科國家衛(wèi)計(jì)委內(nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

研究論文

新發(fā)睪丸決定基因SRY突變導(dǎo)致46,XY性發(fā)育異常三例

王 曦，聶 敏，劉兆祥，茅江峰，伍學(xué)焱*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 協(xié)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 內(nèi)分泌科國家衛(wèi)計(jì)委內(nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

目的在46,XY性發(fā)育異常疾病(46,XY DSD)患者中進(jìn)行SRY突變檢測，分析其發(fā)生頻率，并總結(jié)檢出SRY突變患者的臨床特點(diǎn)。方法納入2009-2014年在北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的46,XY DSD患者63例，收集詳細(xì)臨床資料，提取外周血基因組DNA，PCR特異性擴(kuò)增SRY并進(jìn)行Sanger測序，通過與在線數(shù)據(jù)庫比對確定突變，分析臨床特點(diǎn)。結(jié)果63例患者中共有三例檢出SRY的3種新突變(約5%)。這三例患者社會(huì)性別均為女性，染色體核型為46,XY，有陰道和子宮結(jié)構(gòu)，性激素符合高促性腺激素性性腺功能減退癥。3種突變分別為：Pro131His、R76C和L35Afs*25。前2種錯(cuò)義突變位點(diǎn)位于HMG box核定位信號(hào)區(qū)，累及高度保守氨基酸，后1種為移碼突變導(dǎo)致HMG box缺失，均嚴(yán)重破壞了SRY蛋白的重要功能結(jié)構(gòu)域。結(jié)論該研究發(fā)現(xiàn)的3種SRY新突變是導(dǎo)致46,XY DSD的病因，SRY突變的檢出率約為5%;對于46,XY DSD患者，建議均行SRY檢測以明確病因。

SRY；性腺發(fā)育不良；性發(fā)育異常疾病

46,XY性腺發(fā)育不良(gonadal dysgenesis，GD)屬于46,XY性發(fā)育異常疾病(disorder of sex development，DSD)，是由于原始性腺分化異常最終形成無功能的條索性腺，即完全性性腺發(fā)育不良(complete gonadal dysgenesis，CGD)，或形成功能不良的睪丸，即部分性性腺發(fā)育不良(partial gonadal dysgenesis，PGD)。雖然很早就提出睪丸決定因子的存在，但直到1990年才明確了首個(gè)睪丸決定基因SRY[1]。隨后在人體內(nèi)證實(shí)了多個(gè)與性腺分化相關(guān)的基因，包括RSPO1、SOX9、NR5A1/SF- 1、WT1、NR0B1/DAX1、WNT4和DHH等。

在所有46，XY GD患者中，SRY突變者占10%～15%[2]，而在攜帶有SRY的46, XX個(gè)體，性腺可分化為睪丸，即睪丸DSD[3]，說明SRY對于睪丸分化有關(guān)鍵作用。SRY位于Y染色體，含有1個(gè)外顯子。SRY突變導(dǎo)致的CGD患者，由于性腺不能分泌雄激素和抗副中腎管激素，故分化形成女性內(nèi)、外生殖系統(tǒng)，多因原發(fā)閉經(jīng)就診，激素檢查符合高促性腺激素性性腺功能減退癥。其性腺往往在盆腔中，惡變風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。本研究擬在46,XY DSD患者中進(jìn)行SRY突變檢測，分析其發(fā)生頻率，并總結(jié)檢出SRY突變患者的臨床特點(diǎn)，為臨床診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 對象

本研究選取了2009-2014年就診于北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科的63例46, XY DSD患者。該研究符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患者監(jiān)護(hù)人已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集：收集患者的初診年齡、社會(huì)性別、雌和孕激素替代、月經(jīng)情況、家族史、外生殖器、盆腔超聲、性腺手術(shù)和病理。

1.2.2 激素檢測方法：用Beckman UniCel DxI 800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，檢測血清雌二醇(estrodiol，E2)、總睪酮(total testosterone，T)、硫酸脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone sulfate，DHEAS)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)水平；放射免疫法檢測17α-羥孕酮(17α-hydroxyprogesterone，17α-OHP)水平(DSL公司)。

1.2.3 DNA提取和SRY突變檢測：在遵循知情同意原則的基礎(chǔ)上，收集患者外周血樣本2 mL/人(EDTA真空抗凝采血管)，于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩；蚪MDNA提取采用德國Qiagen公司全血DNA提取試劑盒。應(yīng)用Sanger測序(PCR擴(kuò)增)檢測SRY基因堿基序列。使用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 7.0和GeneRunner(Version 3.05)進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)，經(jīng)NCBI Blast確保引物高度特異性(表1)。

1.2.4 錯(cuò)義突變致病性預(yù)測：用國際上公認(rèn)的蛋白功能預(yù)測軟件SIFT(http:// http://sift.jcvi.org/)、Polyphen- 2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org/)對錯(cuò)義突變進(jìn)行蛋白功能預(yù)測分析。

表1 SRY的PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequences of PCR amplification of SRY

2 結(jié)果

63例46, XY DSD患者中共有三例檢出SRY突變(約5%)。

病例一于11歲曾有兩次月經(jīng)來潮，間隔1個(gè)月，量少。此后閉經(jīng)，16歲起接受雌和孕激素替代治療，有規(guī)律陰道流血，就診前1年停用。就診時(shí)26歲，查體為女性外陰，陰毛1期。性激素結(jié)果符合高促性腺激素性性腺功能減退，盆腔超聲性腺顯示不清，行手術(shù)探查并切除性腺，病理為條索性腺，術(shù)后繼續(xù)雌和孕激素治療。SRY檢測結(jié)果為錯(cuò)義突變c.392C>A(p.Pro131His)，保守性分析軟件預(yù)測為致病突變。

病例二因原發(fā)閉經(jīng)就診，5年前曾接受雌和孕激素治療3個(gè)月，有月經(jīng)來潮，后自行停用。就診時(shí)25歲，查體為女性外陰，陰毛1期。性激素結(jié)果符合高促性腺激素性性腺功能減退，盆腔超聲性腺顯示不清，拒絕行性腺切除手術(shù)。SRY檢測結(jié)果為錯(cuò)義突變c.226C>T(p.Arg76Cys)，保守性分析軟件預(yù)測為致病突變。

病例三表現(xiàn)為原發(fā)閉經(jīng)，18歲至就診時(shí)(22歲)接受雌和孕激素治療，有規(guī)律的陰道流血。查體陰毛5期，陰蒂直徑1 cm。性激素結(jié)果符合高促性腺激素性性腺功能減退，伴高雄激素血癥。促腎上腺激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、DHEAS和17α-OHP結(jié)果可除外腎上腺來源高雄激素血癥。盆腔超聲疑似雙側(cè)卵巢回聲，拒絕行性腺切除。SRY檢測結(jié)果為移碼突變c.103_106delCTTT(p.Leu35Alafs*25)，Mutation Taster軟件預(yù)測為致病突變。

上述三例患者的臨床資料(表2)各異，既往體健，無類似家族史。常規(guī)檢查和肝腎功能正常，外周血染色體核型均為46,XY。SRY測序(圖1)均發(fā)現(xiàn)突變，功能預(yù)測(表3)和保守性分析(圖2)提示為致病突變。

3 討論

SRY位于Yp11.3，包含1個(gè)外顯子，基因產(chǎn)物SRY蛋白是由204個(gè)氨基酸構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄因子，包含1個(gè)位于中央的由80個(gè)氨基酸組成的HMG(high-mobility-group) box區(qū)域以及兩端的側(cè)翼區(qū)[4]。

本研究納入的3個(gè)突變均為既往未報(bào)道過的新突變。病例一和病例二均為錯(cuò)義突變， 分別位于HMG box內(nèi)C端和N端的核定位信號(hào)(nuclear localization signal，NLS)區(qū)，此區(qū)域?qū)RY蛋白核轉(zhuǎn)運(yùn)有重要作用[5]。這兩個(gè)位點(diǎn)氨基酸在多個(gè)物種中均十分保守，蛋白預(yù)測軟件的結(jié)果均支持其為致病突變。病例3為移碼突變，導(dǎo)致HMG box區(qū)域完全缺失。文獻(xiàn)中報(bào)道過的無義突變分散在整個(gè)SRY中，而錯(cuò)義突變集中于HMG box區(qū)，且此區(qū)域氨基酸序列高度保守，說明HMG box是SRY蛋白功能的關(guān)鍵區(qū)域?，F(xiàn)已證明部分位點(diǎn)氨基酸的改變會(huì)影響SRY蛋白的DNA結(jié)合能力(V60L、R62G、I68T、R75N、L94P、G95R、K106I、Y127C、M64I、I90M、S91G、P125L和A113T)、DNA彎曲能力(M64I)或?qū)煞矫娑加杏绊?R62G, M78T)[6]。故本研究中的3種突變均對SRY蛋白的功能產(chǎn)生較大影響，為致病突變。

表2 三例患者的臨床資料Table 2 Clinical data of the 3 cases

*Reference value of follicular phase in women of childbearing age.

A.case 1；B.case 2；C.case 3圖1 三例患者SRY測序圖Fig 1 SRY sequencing results of the 3 cases

case123SRYmutationtypemissensemissenseframeshiftSRYnucleotidechangec.392C>Ac.226C>Tc.103_106delCTTTSRYaminoacidchangep.Pro131Hisp.Arg76Cysp.Leu35Alafs*25SIFTprediction(+)(+)Polyphen-2prediction(+)(+)MutationTasterprediction(+)(+)(+)

A.case 1；B.case 2圖2 2例SRY錯(cuò)義突變位點(diǎn)所編碼氨基酸在不同哺乳動(dòng)物間的保守性分析

本研究中病例一雖有短暫的“月經(jīng)初潮”，但臨床上未見男性化，且性腺病理證實(shí)其并無內(nèi)分泌功能，符合CGD診斷。病史中的出血可能并非月經(jīng)來潮。病例2符合典型的CGD臨床表現(xiàn)。病例3還同時(shí)存在高雄激素血癥，符合PGD表現(xiàn)。但其SRY為移碼突變，HMG box完全缺失，預(yù)測SRY蛋白功能受損嚴(yán)重。且文獻(xiàn)中所報(bào)道的SRY突變所致的PGD，其突變位點(diǎn)多在3’側(cè)翼區(qū)[7]，因此臨床表現(xiàn)與突變類型不符。猜測存在體細(xì)胞嵌合體的可能，即單側(cè)性腺內(nèi)存在攜帶野生型SRY的細(xì)胞，分化出少量睪丸組織。因DHEAS不高，可基本除外腎上腺疾病[8]。性索間質(zhì)腫瘤可分泌雄激素，但與46,XY GD患者發(fā)生的生殖細(xì)胞腫瘤并非同類。因患者拒絕行性腺探查和切除術(shù)，故未能明確。

46,XY性腺發(fā)育不良患者的治療除了性激素替代(根據(jù)社會(huì)性別選擇)以外，對于性腺位于盆腔內(nèi)者，由于其惡變率高達(dá)15%～35%[9]，惡變發(fā)生的高峰在青春期或青春期后[10]，故所有患者均建議行性腺切除。本研究中僅病例一行性腺切除，其余二例仍需在隨訪中警惕惡變風(fēng)險(xiǎn)。

本研究的不足和局限性：1)未能從分子水平證實(shí)基因突變對蛋白功能即對下游基因轉(zhuǎn)錄的影響。2)病例3雄激素水平升高的原因有待明確。

總之，SRY是性別決定的經(jīng)典基因之一，SRY突變是導(dǎo)致46,XY DSD的較常見原因。本研究總結(jié)了三例SRY突變導(dǎo)致的46,XY DSD，均為新發(fā)突變，在既往文獻(xiàn)中未見報(bào)道。對于臨床符合46,XY DSD的患者，均建議行SRY檢測明確診斷。后續(xù)治療需警惕性腺惡變風(fēng)險(xiǎn)，故性腺探查和手術(shù)切除是改善預(yù)后的重要治療。

[1] Sinclair AH, Berta P, Palmer MS,etal. A gene from the human sex-determining region encodes a protein with homology to a conserved DNA-binding motif[J]. Nature, 1990, 346: 240- 244.

[2] Hughes IA. Disorders of sex development: a new definition and classification[J]. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 2008, 22: 119- 134.

[3] Ocal G, Berberoglu M, Siklar Z,etal. Clinical review of 95 patients with 46,XX disorders of sex development based on the new Chicago classification[J]. J Pediatr Adolesc Gynecol, 2015, 28: 6- 11.

[4] Harley VR, Layfield S, Mitchell CL,etal. Defective importin beta recognition and nuclear import of the sex-determining factor SRY are associated with XY sex-reversing mutations[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100: 7045- 7050.

[5] Helszer Z, Dmochowska A, Szemraj J,etal. A novel mutation (c. 341A>G) in the SRY gene in a 46,XY female patient with gonadal dysgenesis[J]. Gene, 2013, 526: 467- 470.

[6] Harley VR, Clarkson MJ, Argentaro A. The molecular action and regulation of the testis-determining factors, SRY (sex-determining region on the Y chromosome) and SOX9 [SRY-related high-mobility group (HMG) box 9][J]. Endocr Rev, 2003, 24: 466- 487.

[7] Hawkins JR, Taylor A, Goodfellow PN,etal. Evidence for increased prevalence of SRY mutations in XY females with complete rather than partial gonadal dysgenesis[J]. Am J Hum Genet, 1992, 51: 979- 984.

[8] Cordera F, Grant C, van Heerden J,etal. Androgen-secreting adrenal tumors[J]. Surgery, 2003, 134: 874- 880.

[9] Hughes IA, Houk C, Ahmed SF,etal. Consensus statement on management of intersex disorders[J]. J Pediatr Urol, 2006, 2: 148- 162.

[10] Cools M. Germ cell cancer risk in DSD patients[J]. Ann Endocrinol (Paris), 2014, 75: 67- 71.

Three cases of novelSRYmutations causing 46,XY disorder of sex development

WANG Xi, NIE Min, LIU Zhao-xiang, MAO Jiang-feng, WU Xue-yan*

(Dept. of Endocrinology, Translational Medicine Center, Peking Union Medical College Hospital, CAMS & PUMC,Key Laboratory of Endocrinology, National Health and Family Planning Commission of People’s Republic of China, Beijing 100730, China)

ObjectiveTo detectSRYmutation in 46,XY disorder of sex development (46,XY DSD), analyzeSRYmutation frequency, and to define the clinical features of the patients with the mutation.MethodsA total of sixty-three 46,XY DSD patients admitted to department of endocrinology of Peking Union Medical College Hospital from 2009 to 2014 were enrolled and detailed clinical data were collected. Genomic DNA was extracted from peripheral blood, andSRYwas amplified and sequenced. The mutation was identified by comparing with the online database, and the clinical features were analyzed.ResultsThree novel mutations ofSRYgene were detected in 3 of 63 patients (5%). The 3 patients’ social genders were all female and their karyotypes are 46, XY. Vaginal and uterine structures were present. Sex hormone profiles were consistent with hypergonadotropic hypogonadism. The 3 novel mutations were Pro131His, R76C and L35Afs*25. The former two were mutations in the nuclear localization signal regions of HMG box and highly-conservative amino acids were affected. The latter one was a frameshift mutation resulting in deletion of the entire HMG box. All these were presumably affecting the functional domain of SRY protein severely.ConclusionsThis study identified three novel mutations ofSRYgene causing 46,XY DSD. The detection rate ofSRYmutation was about 5%. It is recommended thatSRYtesting be performed to identify the etiology of the disease.

SRY; gonadal dysgenesis; disorder of sex development

2017- 10- 27

2017- 11- 20

國家自然科學(xué)基金(81771576)；國家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(2016YFC0905102)；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程(2016-I2M- 1- 002)

*通信作者(correspondingauthor)：wsheyan@vip.sina.com

1001-6325(2018)01-0026-06

R588.1

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