肥胖抑制素減輕高糖致大鼠INS1細(xì)胞的凋亡

徐 敏，王 威，姜方旭，喬 虹，張 玲

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 內(nèi)分泌與代謝病科， 黑龍江 哈爾濱 150086； 2.西澳大學(xué)Harry Perkins醫(yī)學(xué)研究院， 尼德蘭茲 WA6009； 3.鄭州市第三人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科,河南 鄭州 450000)

研究論文

肥胖抑制素減輕高糖致大鼠INS1細(xì)胞的凋亡

徐 敏1,3，王 威1*，姜方旭2，喬 虹1，張 玲1

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 內(nèi)分泌與代謝病科， 黑龍江 哈爾濱 150086； 2.西澳大學(xué)Harry Perkins醫(yī)學(xué)研究院， 尼德蘭茲 WA6009； 3.鄭州市第三人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科,河南 鄭州 450000)

目的探討肥胖抑制素(OB)減輕高糖致大鼠胰島細(xì)胞系INS1細(xì)胞的凋亡作用。方法INS1細(xì)胞在不同糖濃度環(huán)境下培養(yǎng)24 h，用MTT法檢測INS1細(xì)胞存活率和增殖；Hoechst33258細(xì)胞核染色法檢測細(xì)胞核形態(tài)學(xué)；酶標(biāo)法檢測caspase- 3活性及OB的保護(hù)作用是否涉及了PI3K；real-time PCR檢測FOXO1、SREBP1c、Bax和PDX- 1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果在高糖條件下，OB促進(jìn)INS1細(xì)胞的增殖，在100 nmol/L濃度時能最大程度促進(jìn)INS1細(xì)胞增殖(與對照組、高糖組相比，P<0.01)。OB能減輕高糖誘導(dǎo)的凋亡(P<0.01)；在高糖組，F(xiàn)OXO1、SREBP1c和Bax基因表達(dá)較對照組增多，PDX- 1表達(dá)減少；反之在OB干預(yù)的高糖組；FOXO1、SREBP1c和Bax表達(dá)減少，PDX- 1表達(dá)增多。結(jié)論OB能夠減輕高糖致大鼠INS1細(xì)胞的損傷作用。

肥胖抑制素；糖毒性；INS1細(xì)胞；保護(hù)作用

2型糖尿病(type 2 mellitus diabetes，T2DM)在全世界發(fā)病率不斷增加，成為一個威脅健康的主要問題[1]。持續(xù)的高血糖癥能夠引起氧化應(yīng)激、ER應(yīng)激和缺氧應(yīng)激等，從而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞數(shù)量及功能下降，最終形成2型糖尿病[2]。肥胖抑制素(obestatin,OB)是2005年在生物信息學(xué)搜索的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，它是由23個氨基酸組成，C末端甘氨酸殘基帶有?；揎椈?，并且由prepro-ghrelin編碼(ghrelin前體)[3]。Obestatin這一術(shù)語起源于拉丁語“obedere”,意為“吞食”,OB意為肥胖抑制素。OB的生理作用最初被認(rèn)為與胃饑餓素(ghrelin)相反，能夠抑制食欲或者促進(jìn)生長激素(GH)的分泌[3]。OB能通過影響糖、脂代謝阻止糖尿病的發(fā)生[4]。但是OB的受體仍存在爭議。有研究顯示，人的胰島細(xì)胞及β細(xì)胞系在炎性反應(yīng)因子作用條件下，OB能夠使PI3K/Akt、ERK1/2及cAMP磷酸化，并能夠促進(jìn)胰島素分泌及相關(guān)基因表達(dá)，從而對胰島β細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[5]。在2型糖尿病患者的胰島中發(fā)現(xiàn)FOXO1的mRNA水平是增加的[6]。FOXO1是PI3K/Akt信號路徑的下游因子。那么，OB在糖毒性條件下，能否對胰島β細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用？這點(diǎn)仍然不清楚。本研究，證實(shí)了在糖毒性條件下，OB對β細(xì)胞的保護(hù)作用涉及了PI3K信號通路、FOXO1因子、ER應(yīng)激、線粒體功能及胰島素信號相關(guān)通路。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠INS1胰島細(xì)胞系(美國康奈爾大學(xué))；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清和0.25%含EDTA胰蛋白酶(Gibco公司)；青鏈霉素(碧云天公司)；D-glucose、噻唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司)；OB(Phenix公司)；細(xì)胞凋亡熒光Hoechst33258試劑盒(北京索萊寶公司)；Trizol、RT-PCR引物(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒(Roche公司)；

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與分組：將INS1細(xì)胞在37 ℃水浴箱中快速復(fù)蘇，培養(yǎng)基重懸將細(xì)胞混懸液立即放入已經(jīng)準(zhǔn)備好的裝有10% FBS RPMI- 1640培養(yǎng)液的離心管中，離心5 min，取出倒掉上清，加入10% FBS RPMI- 1640培養(yǎng)液4 mL，把細(xì)胞吹打混勻，移入25 cm2的培養(yǎng)瓶中，放入5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，待增殖至瓶壁75%時即可傳代。

1.2.2 MTT法測定細(xì)胞增殖測定：將INS1細(xì)胞分為對照組(11.1 mmol/L)和高糖組(55.5 mmol/L)在1640培養(yǎng)基中，加或不加OB(濃度為1、10、100和500 nmol/L)接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)后放入5% CO237 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，4 h后終止孵育，小心棄去上清，注意盡量避免吸取紫色結(jié)晶(formazan,甲瓚)，加入DMSO 150 μL/孔，放入空氣搖床中，搖晃10 min，使DMSO與甲瓚充分融合。然后將96孔板放入酶聯(lián)免疫檢測儀中，波長調(diào)至570 nm，開始檢測每個孔的A值。

1.2.3 Hoechst33258細(xì)胞核染色：使用6孔板，在孔板中放入已經(jīng)高壓、滅菌的蓋玻片，放入細(xì)胞對照組和高糖組的懸液，待細(xì)胞爬片。之后棄去上清，分為對照組及高糖組放入5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察，INS- 1細(xì)胞增殖至覆蓋底部面積的約50%～80%，吸去上清，加入固定液0.5 mL，固定10 min。之后吸去固定液，使用PBS洗2遍，每次3 min，盡量吸凈液體。在載玻片上滴上1滴抗熒光衰減劑，小心蓋上有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞小心接觸封片液，避免產(chǎn)生氣泡。使用熒光顯微鏡觀察，調(diào)整最大激發(fā)波長為352 nm，最大發(fā)射波長為461 nm。對照組細(xì)胞核為藍(lán)色橢圓形，高糖組細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮和核碎裂現(xiàn)象。

1.2.4 酶標(biāo)法caspase- 3活性檢測：參照caspase- 3細(xì)胞活性檢測試劑盒進(jìn)行檢測。在對照組及高糖組加或不加obestatin(100 nmol/L)以及PI3K阻斷劑LY294002(LY)干預(yù)24 h，后開始收集細(xì)胞，按照每200萬個細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液的比例進(jìn)行細(xì)胞裂解，冰浴裂解15 min，4 ℃ 16 000～20 000×g離心15 min，把上清移入預(yù)冷的離心管，立即測定caspase- 3細(xì)胞活性。

1.2.5 Real-time PCR測定FOXO1、Bax、SREBP1c、PDX1 mRNA的表達(dá)情況：分組干預(yù)后收集細(xì)胞離心，按照Trizol試劑說明書提取RNA，測取濃度并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用SYBR Green熒光染料法進(jìn)行real-time PCR測定。各引物序列：β-action：5′-CCTG TGGCATCCATGAAACTAC-3′(上游)，5′-CCAGGG CAGTAATCTCCTTCTG-3′ (下游)；FOXO1：5′-ACA CCATGCCTCACACATCTG-3′ (上游)，5′-GGAGGAC ACCCATCCTACCA-3′(下游)；Bax:5′-AGCGAGT GTCTCAGGCGAAT-3′ (上游) 5′-CCGGCCCCAGTT GAAGTT-3′(下游)；SREBP1c：5′-GCCCAGGTGACC CGACTATT-3′ (上游)，5′-GACAGCGTCAGAACAG CTATTTAGC-3′ (下游)；PDX1：5′-GAGCTGGCAGT GATGATGCTCAA-3′ (上游)，5′-ACAATCCTGCTC CGGCTCTT-3′ (下游)。基因表達(dá)量使用2-△△Ct相對定量法計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 在高糖毒性條件下， OB能促進(jìn)細(xì)胞INS1的增殖

高糖組的增殖率低于對照組(P<0.01)。在對照組和高糖組，OB在100 nmol/L時能夠達(dá)到最大增值率，與對照組相比增值率達(dá)137%(P<0.01)，與高糖組相比增值率達(dá)37%(P<0.01)。無論是在對照組還是高糖組OB濃度至少在10 nmol/L時才能促進(jìn)β細(xì)胞增殖(圖1)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control；#P<0.05，##P<0.01 compared with high glucose圖1 在高糖條件下，OB促進(jìn)INS1細(xì)胞的增殖Fig 1 OB promotes INS1 cells proliferation under glucotoxicity state(±s, n=5)

2.2 在糖濃度為55.5mmol/L條件下， INS1細(xì)胞核出現(xiàn)固縮和碎裂

在對照組可見到細(xì)胞核呈藍(lán)色橢圓形，高糖組中可見到細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、碎裂(圖2)。

圖2 高糖濃度對INS1細(xì)胞核的影響Fig 2 Effect of glucose with higher concentrations on INS1 nucleus morphology were detected by Hoechst33258(original magnification ×400)

2.3 OB保護(hù)β細(xì)胞拮抗高糖誘導(dǎo)凋亡，涉及了PI3K信號通路

胰島β細(xì)胞在對照組和高糖組加或不加PI3K阻斷劑LY294002(LY)和OB，OB的濃度為100 nmol/L，LY的濃度為50 μmol/L。對照組+ LY組caspase- 3活性和對照組相比顯著增高(P<0.05)，對照組+OB組caspase- 3活性和對照組相比顯著降低達(dá)36%(P<0.01)，對照組+OB+LY組caspase- 3活性和對照組+OB組相比顯著升高達(dá)31%(P<0.05)，對照組+OB+LY組caspase- 3活性和對照組+LY組相比降低達(dá)32%(P<0.01)。高糖組caspase- 3活性明顯升高與對照組相比(P<0.01)，高糖組+OB組caspase- 3活性和高糖組相比顯著降低達(dá)43%(P<0.01)。高糖組+OB+LY組caspase- 3活性和高糖組+OB組相比顯著升高達(dá)57%(P<0.05)，高糖組+OB+ LY組caspase- 3活性和高糖組+LY組相比顯著降低達(dá)36%(P<0.01)(圖3)。

2.4 OB涉及了 FOXO1、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及胰島素相關(guān)通路

1)高糖組與對照組比較FOXO1基因表達(dá)明顯增多(P<0.05)；對照組+OB組與對照組比較FOXO1基因表達(dá)明顯減少(P<0.01)；高糖組+OB組與高糖組比較，F(xiàn)OXO1基因表達(dá)明顯減少(P<0.01)。2)高糖組與對照組比較Bax基因表達(dá)明顯增多(P<0.01)；對照組+OB組與對照組比較Bax基因表達(dá)明顯減少(P<0.01)；高糖組+OB組與高糖組比較，Bax基因表達(dá)明顯減少(P<0.05)。3)高糖組與對照組比較SREBP1c基因表達(dá)明顯增多(P<0.01)；高糖組+OB組與高糖組比較，SREBP1c基因表達(dá)明顯減少(P<0.05)。4)對照組與高糖組比較PDX1基因表達(dá)明顯減少，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；對照組與對照組+OB組比較PDX1基因表達(dá)增多(P<0.05)；高糖組與高糖組+OB組比較，PDX1基因表達(dá)明顯減少(P<0.05)； 糖濃度為高糖組+OB組與高糖組比較， PDX1基因表達(dá)明顯減少(P<0.01)(圖4)。

*P<0.05，**P<0.01；#P<0.05，##P<0.01 圖3 在高糖條件下，OB能夠影響INS1細(xì)胞caspase- 3活性并且這與PI3K通路相關(guān)Fig 3 Under high glucose state,the effect of OB on caspase- 3 activity of INS1 pancreatic β-cells and its association with PI3K path way

3 討論

OB是最近新發(fā)現(xiàn)的一種激素，是由ghrelin前體(prepro-ghrelin)基因編碼，能夠促進(jìn)β細(xì)胞和人的胰島細(xì)胞存活，促進(jìn)胰島素分泌，但是其具體的分子機(jī)制仍然不是很明確[5]。OB是否保護(hù)2型糖尿病患者中處于高糖環(huán)境的胰島β細(xì)胞仍有待確定。在本研究中發(fā)現(xiàn)，在高糖條件下OB能促進(jìn)β細(xì)胞的增殖；OB能抑制高糖條件下誘導(dǎo)的凋亡，這與PI3K通路相關(guān)；其保護(hù)作用涉及ER應(yīng)激、線粒體、胰島素信號通路以及FOXO1因子。

高糖能夠刺激胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激、ER應(yīng)激、缺氧應(yīng)激以及誘導(dǎo)炎性反應(yīng)因子水平增加，使胰島β細(xì)胞發(fā)生凋亡、自噬、去分化以及增值降低，最終引起β細(xì)胞數(shù)量及功能障礙[6- 8]，最終形成2型糖尿病。有研究顯示OB在炎性反應(yīng)介質(zhì)環(huán)境下，能夠磷酸化PI3K、ERK1/2、CAMP和IRS2信號路徑，從而保護(hù)大鼠胰島β細(xì)胞以及人的胰島細(xì)胞[5]。但是目前還沒有研究證明，在高糖條件下OB對胰島β細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用機(jī)制。PI3K通路與胰島細(xì)胞增殖和胰島素分泌關(guān)系非常密切， FOXO1是PI3K信號路徑的下游因子[9- 11]。 有研究證明， 在一項關(guān)于人的研究中證明了在2型糖尿病患者的胰島中發(fā)現(xiàn)FOXO1的mRNA水平是增加的[12]。此次研究，證明了在高糖條件下，OB能夠促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖；OB能抑制高糖誘導(dǎo)的凋亡，這與PI3K通路相關(guān)；OB對胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用涉及了FOXO1因子、ER應(yīng)激、線粒體及胰島素相關(guān)通路。

A.FOXO1 gene expression; B.Bax gene expression; C.SREBP1c gene expression; D.PDX- 1 gene expression;*P<0.05，**P<0.01 compared with control；#P<0.05，##P<0.01 compared with high glucose

本次實(shí)驗證明了在高糖條件下能夠最大抑制胰島β細(xì)胞的活性達(dá)24%，在形態(tài)學(xué)證實(shí)了高糖能夠使細(xì)胞核發(fā)生變化，核固縮和核碎裂(圖3)。有報道證實(shí)，OB在100 nmol/L時能夠?qū)σ葝u細(xì)胞產(chǎn)生最大的促增殖作用[5]。這次研究也證實(shí)了這個結(jié)論，OB濃度為100 nmol/L時能夠?qū)σ葝u細(xì)胞產(chǎn)生最大的促增殖作用，OB起保護(hù)作用的濃度至少是10 nmol/L。OB在500 nmol/L的濃度增值率與濃度100 nmol/L OB相比稍下降，可能與受體飽和有關(guān)。

caspase- 3是凋亡的標(biāo)志物，為了進(jìn)一步探討OB在高糖條件下能否拮抗INS1細(xì)胞的凋亡，在對照組和高糖組分別加入濃度為100 nmol/L的OB，發(fā)現(xiàn)加入OB后caspase- 3活性明顯下降，認(rèn)為OB能夠拮抗高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步證實(shí)OB能夠拮抗高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否與PI3K通路相關(guān)，加入了PI3K通路阻斷劑LY294002，通過caspase- 3的變化證實(shí)了OB保護(hù)β細(xì)胞拮抗高糖誘導(dǎo)的凋亡，這與PI3K信號通路相關(guān)。這次實(shí)驗也證明了OB不能夠完全拮抗高糖引起的凋亡，暗示了存在其他通路參與了這個過程。

高血糖能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、ER應(yīng)激、缺氧應(yīng)激以及誘導(dǎo)炎性反應(yīng)因子的水平增加[13]。為了進(jìn)一步探索OB對胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用是否涉及了FOXO1因子、ER應(yīng)激、線粒體及胰島素相關(guān)通路。在高糖組FOXO1 mRNA表達(dá)的量與對照組相比明顯增加，這點(diǎn)與在一項關(guān)于人的研究中證明了在2型糖尿病患者的胰島中發(fā)現(xiàn)FOXO1的mRNA水平是增加的[14]相一致。促凋亡基因BCL2家族成員基因Bax基因，這個基因與線粒體相關(guān)，在高糖組也出現(xiàn)類似的結(jié)果，加入OB后FOXO1和Bax表達(dá)明顯下降，認(rèn)為OB拮抗高糖組保護(hù)β細(xì)胞涉及了FOXO1因子和線粒體通路。SREBP1c是轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白- 1C，是一個轉(zhuǎn)錄因子，是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜合成，CHOP- 10是促凋亡CCAAT/增強(qiáng)結(jié)合蛋白(C/EBP),也被稱作GADD153，它是C/EBP家族的轉(zhuǎn)錄因子[15]，這兩者都是公認(rèn)的ER應(yīng)激標(biāo)志物。在高糖條件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物CHOP- 10和SREBP1c與對照組相比表達(dá)增多，加入OB后CHOP- 10、SREBP1c表達(dá)明顯降低，認(rèn)為OB拮抗高糖保護(hù)β細(xì)胞涉及了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)路徑。在高糖條件下OB保護(hù)β細(xì)胞與CHOP- 10下調(diào)有關(guān)。PDX- 1是一個控制β細(xì)胞增殖和胰島素分泌功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，具有促進(jìn)胰島素的合成和分泌作用，INS1是胰島素相關(guān)基因。本次實(shí)驗結(jié)果也表現(xiàn)出在高糖組PDX- 1和INS1表達(dá)是降低的，加入OB后PDX- 1和INS1表達(dá)是增高的，由此推測OB對胰島細(xì)胞的保護(hù)作用涉及了胰島素信號通路。

總之，在高糖條件下，OB對胰島細(xì)胞的保護(hù)作用涉及FOXO1因子、ER應(yīng)激、線粒體路徑和島素信號通路。雖然目前對于OB作用的受體不明確，但是OB對于胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用將會成為對于糖尿病治療的一個新策略。

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Obestatin attenuates apoptosis induced by high glucose in INS1 cells

XU Min1,3, WANG Wei1*, JIANG Fang-xu2, QIAO Hong1, ZHANG Ling1

(1.Dept. of Endocrinology and Metabolism， the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086,China;2.Harry Perkins Institute of Medical Research, University of Western Australia, Nedlands WA 6009, Australia;3.Dept. of Endocriology, the Third People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of obestatin on the apoptosis of rat pancreatic islet cell line INS1 induced by high glucose.MethodsINS1 cells were cultured in different concentrations of glucose.The survival rate and proliferation of INS1 cells were detected by MTT method;Hoechst33258 nuclear staining was used to detect nuclear morphology. caspase- 3 method was used to study the relationship between the protective effect of obestatin and the PI3K pathway; Finally，using real-time PCR detection ofFOXO1 andSREBP1c,Bax,PDX- 1 expression, to further clarify the protective effect of obestatin on cells.ResultsIn high glucose condition,obestatin promoted the proliferation of INS1 cells at 100 nmol/L,and promoted the proliferation of INS1 cells significantly(P<0.01, compared with the control group and high glucose group).Obestatin can reduce high glucose-induced apoptosis(P<0.01).The expressions ofFOXO1,SREBP1c,BaxandPDX- 1 decreased,while the expression ofFOXO1,SREBP1c,BaxandPDX- 1 increased in high glucose group.ConclusionsOB can attenuate the injury of INS1 cells induced by high glucose in rats.

obestatin; glucotoxicity;INS1 cells; protection

2016- 06- 16

2017- 02- 09

國家自然科學(xué)基金(81471081);黑龍江省自然科學(xué)基金(H201416);黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(11551199);哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院博士基金(BS2011- 12)

*通信作者(correspondingauthor)：wwei19742007@hotmail.com

1001-6325(2018)01-0007-06

IQ291

A