心痛泰顆粒對動脈粥樣硬化小鼠血脂及TNF-α、IL-6影響的實驗研究

譚娣娣 李 雅△ 郭志華 易 瓊 劉建和 謝帆慈 劉 俊

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007）

動脈粥樣硬化（AS）系指血脂和血管壁成分逐漸改變的動脈疾病，常易損害彈性動脈和彈性纖維肌性動脈［1］。脂類物質(zhì)不斷累積動脈血管內(nèi)膜，使得內(nèi)膜纖維逐漸變厚，病變深處則由壞死組織、細(xì)胞外脂質(zhì)池等成分組成。血壓、血脂、血糖、同型半胱氨酸水平異常等是AS的發(fā)生的常見原因。炎癥反應(yīng)是動脈粥樣硬化發(fā)生的核心機(jī)制，伴隨著AS從發(fā)生發(fā)展到惡變的所有變化情況［2］。血脂異常刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞可引起炎性細(xì)胞釋放，逐漸轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮下，轉(zhuǎn)換成巨噬細(xì)胞，吞滅組織脂蛋白并轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，演變?yōu)橹|(zhì)斑塊，不穩(wěn)定粥樣斑塊易引起出血、鈣化、血栓、動脈瘤等，導(dǎo)致急性心腦血管事件［3］。研究表明［4］中醫(yī)藥針對動脈粥樣硬化的不同病理環(huán)節(jié)能夠同時發(fā)揮作用，可以降低血脂、控制炎癥反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮功能，可明顯減輕急性冠脈綜合征的臨床征象。導(dǎo)師根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗，自擬活血化瘀、理氣止痛之中成藥心痛泰顆粒，用于臨床治療動脈粥樣硬化，臨床療效顯著。本研究按照AS小鼠模型動物實驗，選取有關(guān)指標(biāo)，討論心痛泰顆粒治療動脈粥樣硬化的臨床效果，替心痛泰在臨床的進(jìn)一步推行使用提供可靠根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級4周齡雄性ApoE-/-小鼠 42 只（品系：C57BL/6J），體質(zhì)量（18±4） g，野生型小鼠（7BL/6J12）12只，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。動物許可證：SCXK（京）2012-0001；合格證號No.11400700009674。

1.2 試藥與儀器 心痛泰顆粒的制備：中藥飲片均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科。丹參15 g，川芎 10 g，三七 3 g，葛根 10 g，郁金 10 g，山楂 15 g，木香5 g，枳殼10 g，炙甘草5 g。兩次水煎提取1 h，過濾，濃縮，微波干燥后粉碎制粒，加部分糊精做成顆粒劑，60℃以下干燥整粒，將成品顆粒裝袋分存，放于陰涼干燥處保存?zhèn)溆?。阿托伐他汀鈣片：購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房。生產(chǎn)商：北京嘉林藥業(yè)股份有限公（國藥準(zhǔn)字號H19990258）。總膽固醇（TC）（保定長城臨床實踐有限公司，9004-1）、三酰甘油（TG）（保定長城臨床實踐有限公司，9003-1）、高密度脂蛋白（HDL-C）（浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司，A0-10037）、低密度脂蛋白（LDL-C）（長春匯利生物技術(shù)有限公司，A029）、 一抗 Rabbit-anti-12320、E-cacdherin-11A24、Fas-L-BA0049（武漢博士德生物工程有限公司）、pv-9000二步法免疫組化檢測試劑（北京中杉金橋，A0210）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6 試劑盒（上海浩然生物技術(shù)有限公司，150-04）、0.9%氯化鈉注射液（湖南科倫制藥有限公司，H4302045）、水合氯醛（天津科密歐試劑有限公司，4218-2009）。主要儀器：電子天平TP-2200B（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司，TP-2200B）、高速離心機(jī) （湘儀天平儀器設(shè)備有限公司，TG16-WS）、全自動生化分析儀（日本東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會社，TBA-120FR）、切片機(jī) （德國徠卡公司，RM2235）、顯微圖像攝影系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，mini protean 3 cell）、-80℃超低溫冰箱 （中科美菱，MDF-U74V）、60℃電熱恒溫干燥箱（中興偉業(yè)儀器有限公司，101A-8）、電子恒溫不銹鋼水浴鍋（Leica萊卡儀器有限公司，HI1210）。

1.3 造模與分組 實驗組選用4周齡雄性ApoE-/-小鼠42只，圈喂于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗室，予高脂飲食（0.15%膽固醇+21%脂肪+普通鼠料）喂養(yǎng)；空白組選取野生型小鼠12只，喂予普通飼料。連續(xù)喂養(yǎng)12周后，從兩種小鼠中各隨機(jī)取出2只，摘眼球取血檢測發(fā)現(xiàn)實驗組TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平明顯升高；HE染色后觀測ApoE-/-小鼠主動脈有明顯動脈粥樣斑塊形成，表明AS模型制備成功（見圖1）。造模成功后，將剩下的40只ApoE-/-小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，分別為模型組、心痛泰低、高劑量組、阿托伐他汀鈣組（他汀組）各10只，外加空白組10只。空白組和實驗組灌胃每日1次，持續(xù)8周?？瞻捉M、模型組予以0.9%氯化鈉注射液灌胃，灌胃容積為15 mL/kg；心痛泰低劑量組按 3 g/（kg·d）（相當(dāng)于成人日用藥量 10 g）、心痛泰顆粒高劑量組按12 g/（kg·d）（相當(dāng)于成人日用藥量 40 g）、他汀組按 3mg/（kg·d）（相當(dāng)于成人日用藥量20mg）灌胃。以上均按照“人-動物體表面等效劑量比值公式”折算。

圖1 造模成功（HE染色，100倍）

1.4 標(biāo)本采集與檢測 1）檢測血脂指標(biāo)，在AS小鼠灌胃結(jié)束后，摘眼球采血 1～1.5mL，3000 r/min，10min離心分離血清，采上清液，置于小試管中，-80℃保存，采用酶法檢測 TC、TG，比色法檢測 LDL-C、HDL-C。2）采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6濃度，摘眼球采血、凝集、取血清，將酶復(fù)合物稀釋，加血清及陰性、陽性對照，經(jīng)過孵育、洗板、加底物，避光反應(yīng)后加終止液并讀數(shù)。3）采用免疫組化法測定TNF-α、IL-6的表達(dá)水平，石蠟切片、脫水、緩沖液清洗，3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加非免疫動物血清20min，滴加一抗、PBS沖洗、滴加二抗、沖洗后加ABC復(fù)合物、DAB顯色，在400倍顯微鏡下觀察，用MIAS圖像分析系統(tǒng)分析，按照免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)在每一高倍視野中所占比例依次統(tǒng)計。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。組間對比如滿足正態(tài)性檢驗，選用單因素方差分析，其中方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Tamhane′s T2分析；不滿足正態(tài)性檢驗用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血脂濃度比較 見表1。與空白組比較，其他各組小鼠血脂差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示造模成功。與模型組相比，心痛泰顆粒低、高劑量組、他汀組均能顯著降低TC、TG、LDL-C水平，且心痛泰顆粒高劑量組比低劑量組效果好（P＜0.05）；而心痛泰顆粒高劑量組與他汀組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組相比，心痛泰顆粒低劑量組、高劑量組、他汀組均能上增HDL-C，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。

表1 各組血脂濃度比較（mmol/L，±s）

表1 各組血脂濃度比較（mmol/L，±s）

與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，▲P＜0.05。 下同。

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2.2 各組血清TNF-α、IL-6水平比較 見表2。與空白組對比，其他各組小鼠TNF-α、IL-6濃度有明顯差異（P＜0.05），提示造模成功。與模型組相比，心痛泰顆粒低劑量組、高劑量組、他汀組均都能明顯降低TNF-α、IL-6水平（P＜0.05），并且高劑量組、他汀組優(yōu)于低劑量組（P＜0.05），他汀組優(yōu)于高劑量組（P＜0.05）。

表2 各組 TNF-α、IL-6 水平比較（mmol/L，±s）

表2 各組 TNF-α、IL-6 水平比較（mmol/L，±s）

組 別 n空白組 10模型組 10低劑量組 10 TNF-α IL-6 0.23±0.02 0.34±0.06 60.13±8.23△ 58.82±9.21△16.25±1.98△* 14.32±0.83△*高劑量組 10 5.33±0.15△*▲ 6.08±0.22△*▲他汀組 10 4.35±1.33△*▲ 4.17±0.66△*▲

2.3 各組TNF-α、IL-6陽性表達(dá)比較 見表3。與空白組相比，其他各組小鼠TNF-α、IL-6陽性表達(dá)有顯然區(qū)別（P＜0.05），提示造模成功。跟模型組對比，心痛泰顆粒低劑量組、高劑量組、他汀組均能明顯下調(diào)TNF-α、IL-6 陽性表達(dá)率（P＜0.05），并且高劑量組、他汀組優(yōu)于低劑量組（P＜0.05），他汀組優(yōu)于高劑量組（P＜0.05）。

表3 各組TNF-α、IL-6陽性表達(dá)率比較（%，±s）

表3 各組TNF-α、IL-6陽性表達(dá)率比較（%，±s）

組 別 n空白組 10模型組 10低劑量組 10 TNF-α IL-6 1.05±0.10 1.04±0.09 27.89±4.07△ 28.88±4.06△14.12±1.75△* 15.10±1.72△*高劑量組 10 8.99±1.24△*▲ 7.98±1.25△*▲他汀組 10 5.33±0.91△*▲ 4.33±0.88△*▲

2.4 免疫組化圖像 見圖2，圖3。取主動脈于400倍光鏡下觀察?？瞻捉M動脈管壁相對均勻，為淡藍(lán)色淺染；模型組動脈管壁周圍棕黃色深染，為中等陽性；心痛泰各組和阿托伐他汀鈣組動脈管壁內(nèi)膜脂質(zhì)浸潤比模型組輕，為弱陽性。

圖2 TNF-α免疫組化圖像（HE染色，400倍）

圖3 IL-6免疫組化圖像（HE染色，400倍）

3 討 論

AS以脂代謝異常為基礎(chǔ)，伴有纖維組織增生、血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、動脈中層漸漸退化、動脈內(nèi)膜斑塊出現(xiàn)，導(dǎo)致動脈壁增厚變硬，血管腔狹窄甚至完全閉塞，組織器官缺血缺氧或壞死為主要病變特征的一種慢性疾?。?］。血脂紊亂是導(dǎo)致AS發(fā)生和發(fā)展的始動及危險因素，各種異常的血漿脂球蛋白沉積動脈血管管壁，導(dǎo)致血管內(nèi)膜的病變。血液中各種血漿脂球蛋白改變均會不同程度推動疾病的演變過程，LDL扮演著非常危險的角色，可以明顯增加心血管事件的進(jìn)展，降低LDL含量可明顯改善心腦血管疾病患者的生存質(zhì)量［6］。相反，作為AS的保護(hù)性脂蛋白，HDL含量越高越能延緩動脈粥樣硬化的形成和進(jìn)展。

TNF-α可以誘導(dǎo)血小板粘附聚集，介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖，刺激內(nèi)皮損傷、參與脂質(zhì)浸潤過程，引起病變進(jìn)展及斑塊變化，誘發(fā)斑塊脫落，導(dǎo)致血栓發(fā)生。IL-6可促使血小板活化，加快凝血進(jìn)程，引起內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞發(fā)生病變并壞死，加快AS的形成，加快ACS和腦卒中的發(fā)生發(fā)展。IL-6可損傷血管內(nèi)皮，干預(yù)巨噬細(xì)胞對LDL攝取，使得脂質(zhì)在血管壁累積，導(dǎo)致AS。此外，血管內(nèi)皮受損能加快TNF-α應(yīng)答，TNF-α亦能引起IL-6反應(yīng)，兩者不斷產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致免疫物質(zhì)圍繞血管內(nèi)皮，血栓出現(xiàn)［7］?？寡缀徒笛委熆梢詼p慢并逆轉(zhuǎn)粥樣斑塊的病變過程，并且能夠調(diào)控粥樣斑塊，改善病患的臨床癥狀，降低并防止急性心腦血管事件進(jìn)一步惡變發(fā)展。

中醫(yī)學(xué)中沒有“動脈粥樣硬化”這名稱，按其臨床表現(xiàn)，屬中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”“脈痹”“血濁”等范圍［8］。 病性屬本虛標(biāo)實，氣滯、痰濁、血瘀是標(biāo)，氣血陰陽虧虛、肝腎不足是本。本病發(fā)病主要與心、肝、肺、脾臟密切相關(guān)，心氣的助力、肺氣的輸布、肝氣的疏泄、脾氣的轉(zhuǎn)輸均推動著血在管腔中環(huán)繞運行。氣機(jī)阻滯難以推動血液的運行，從而瘀滯不通；血瘀日久，又反作用于氣機(jī)郁滯，因此氣血實屬兩個互根互用的存亡體，說明了氣滯血瘀是AS發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)［9］。針對氣滯血瘀型動脈粥樣硬化的治療，心痛泰顆粒具有活血化瘀、理氣止痛的功效。全方由丹參、川芎、三七、郁金、山楂、木香、葛根、枳殼、炙甘草組成。方中丹參活血祛瘀止痛，與“血中氣藥”川芎合用為君；三七散瘀消腫止痛，郁金行氣解郁，山楂行氣散瘀，木香理氣止痛，四藥助君藥加強(qiáng)調(diào)暢氣機(jī)，祛瘀止痛之功效，合而為臣；佐以葛根解肌退熱，枳殼理氣化痰，一升一降共調(diào)氣機(jī)；使以炙甘草調(diào)和諸藥。諸藥配伍，使氣機(jī)暢，瘀血散，胸陽振，氣血調(diào)，脈絡(luò)得以濡養(yǎng)，從而達(dá)到抗動脈粥樣硬化的作用［10-15］。

本動物實驗結(jié)果表明，心痛泰能明顯下調(diào)AS小鼠TC、TG、LDL-C濃度，上調(diào)HDL-C水平，可抑制TNF-α、IL-6的陽性表達(dá)，改善動脈組織病理變化，縮小粥樣斑塊面積，提示心痛泰可能通過降脂、減輕動脈炎癥、調(diào)控斑塊來達(dá)到抗動脈粥樣硬化的目的。

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