追風(fēng)透骨膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織中miR-155、TGF-β1表達(dá)的影響*

柳慶坤 梁云清 劉 偉 吳 劍

（河北省安國市醫(yī)院，河北 安國 071200）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種復(fù)雜的、多系統(tǒng)的、以多關(guān)節(jié)滑膜組織慢性炎癥為顯著特征的自身免疫系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率及致殘率極高，嚴(yán)重危害人類健康［1］。因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且不明確，成為臨床較難根治的疾病之一。目前針對RA的治療主要以西藥和生物療法為主，但西藥的毒副作用大、生物制劑的價格昂貴等缺點(diǎn)，導(dǎo)致臨床適用性較差，難以普遍推廣。近期有關(guān)研究提出，RA由多個組織器官病變引起，與中醫(yī)藥多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)治療特點(diǎn)不謀而合［2］。其中追風(fēng)透骨膠囊（ZFTG）以疏通經(jīng)絡(luò)、祛風(fēng)濕、鎮(zhèn)痛祛寒的功效［3］及療效好、副作用小、患者依從性強(qiáng)等優(yōu)勢，逐漸成為RA治療的首選?；诖?，本文通過研究中藥復(fù)方制劑ZFTG對RA大鼠關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織中微小RNA-155（miR-155）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）表達(dá)的影響闡述其治療RA的作用機(jī)制，為其臨床推廣提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。生炎癥進(jìn)行造模。取建模成功的大鼠60只隨機(jī)分為6組， 分別為模型組、ZFTG 低劑量組 ［200 mg/（kg·d］、ZFTG 中 劑 量 組 ［400 mg/（kg·d）］、ZFTG 高 劑 量 組［800mg·（kg/d）］、陽性對照組（每天給予地塞米松 2mg/kg），模型組與正常組每日分別以等量的 （4 mL）0.9%氯化鈉注射液灌胃。分別于造模第7日開始給藥，連續(xù)給藥4周。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 給藥后第28日以脫頸法將大鼠處死，滑膜液取樣：無菌條件下，以鑷子拉開造模足踝關(guān)節(jié)，以注射器吸取關(guān)節(jié)滑膜液，保存于-80℃冰箱中備用。關(guān)節(jié)滑膜組織的留?。貉睾笾リP(guān)節(jié)正中縱行切開，暴露出膝關(guān)節(jié)中心約3 cm×3 cm的區(qū)域，無菌剝離出滑膜組織，以無菌0.9%氯化鈉注射液清洗后，快速放入1‰DEPC處理的EP管中，備用。1）大鼠足腫脹程度測定。分別以容積檢測儀測定并記錄各組給藥后第 7、14、20、24、28 日大鼠右后足的腫脹體積變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用性成熟的SPF級健康未交配SD大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京農(nóng)學(xué)院，動物合格證號SYXK（京）2015-0004；飼養(yǎng)環(huán)境：室溫18～22℃、相對濕度40%～50%、標(biāo)準(zhǔn)飼料和水飼養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑 足趾容積檢測器，型號KY811，北京凱云儀科技有限公司；熒光定量PCR儀，北京時代新維測控設(shè)備有限公司。Ⅱ型膠原，10 mg/支，購于上海本草生物醫(yī)學(xué)工程研究所；弗氏完全佐劑，10 mg/支，購于北京華越洋生物科技有限公司；TGF-β1、ELISA試劑盒，均購于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；Western blot印跡全套試劑盒，購于上海西寶生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品 ZFTG，批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字Z20083219，規(guī)格為0.26 g/粒，廠家為湖南德康制藥股份有限公司；地塞米松片，批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字H44024276，規(guī)格為0.75mg/片，廠家為廣東三才石岐制藥有限公司。

1.4 試藥的配制 ZFTG灌胃溶液制備，分別稱取ZFTG內(nèi)容物2.5 g，5 g，10 g于50mL量瓶中，以0.9%氯化鈉注射液稀釋并定至刻度，搖勻，即得ZFTG低劑量、中劑量、高劑量混懸液 （質(zhì)量濃度分別為0.05 g/mL、0.1 g/mL、0.2 g/mL）；CⅡ乳劑的制備： 無菌條件下，?、蛐湍z原以0.1 moL/L的冰乙酸充分溶解制得濃度為2mg/mL，置于4℃冰箱中靜置過夜，與弗氏完全佐劑等體積混合，振蕩乳化即得（每1mL含1mg CⅡ），于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 造模與分組 取80只大鼠，隨機(jī)選出10只為空白組，其余70只均參照文獻(xiàn)［4-5］方法，以CⅡ乳劑于每只大鼠左后足跖進(jìn)行皮內(nèi)注射0.25 mL，誘導(dǎo)其發(fā)2）大鼠滑液及滑膜組織中miR-155、TGF-β1基因表達(dá)水平的測定。以實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）法測定大鼠關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織中miR-155的相對表達(dá)量：以RNA提取試劑盒，提取大鼠關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織的總RNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR，PCR的反應(yīng)體系為：5X緩沖液5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，上游引物F 1 μL，下游引物 R 1 μL，10 mM dNTPmix 0.5 μL，cD NA 0.5μL，ddH2O 16.5μL；PCR 的反應(yīng)條件如下。 預(yù)變性：94℃ 3min。變性：94℃ 30 s。 退火：55℃ 15 s（miR-155和GAPDH）。延伸：72℃ 1min，25個循環(huán)。再延伸：72℃5min。引物序列均由廣州華大生物科技有限公司完成；引物序列，miR-155上游引物F：5′-CTGTTAATGCTAATTGTGAT-3′。 下游引物 R：5′-CTGTTAATGCTAACAGGT AG-3′；TGF-β1 上游引物 F：5′-GGGAAGAGGTCCCTGAGACC-3′。 下游引物 R：5′-AGTCAAATTTGTTTTA AGCT-3′。 3）大鼠滑液及滑膜組織中TGF-β1蛋白表達(dá)水平的測定。采用酶聯(lián)免疫吸附 （ELISA）法測定大鼠關(guān)節(jié)滑液中TGF-β1的含量，步驟嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行，以蛋白免疫印跡（Western blot）法［6］檢測關(guān)節(jié)滑膜組織中 TGF-β1 蛋白的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計數(shù)資料用百分率（%）表示，組間差異分析采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠足腫脹體積比較 見表1。模型組及各治療組腫脹體積均大于空白組；隨ZFTG劑量的增加，腫脹體積逐漸減?。≒＜0.05）。

表1 各組大鼠足腫脹體積比較（mL，±s）

表1 各組大鼠足腫脹體積比較（mL，±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽性對照組比較，△P＜0.05。 下同。

24 d 28 d 1.20±0.09 1.23±0.17 1.82±0.12* 1.85±0.14*1.59±0.13# 1.67±0.19#ZFTG 低劑量組 10 1.56±0.12△ 1.58±0.11△ 1.68±0.14△ 1.76±0.18△ 1.82±0.16△ZFTG 中劑量組 10 1.43±0.17# 1.49±0.14# 1.52±0.16# 1.57±0.17# 1.65±0.12#ZFTG 高劑量組 10 1.36±0.13#△ 1.38±0.12#△ 1.41±0.14#△ 1.45±0.15#△ 1.51±0.14#△組 別 n空白組 10模型組 10陽性對照組 10 7 d 14 d 20 d 0.96±0.12 1.05±0.14 1.14±0.12 1.58±0.11* 1.67±0.16* 1.78±0.14*1.45±0.14# 1.48±0.15# 1.54±0.16#

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑液中miR-155、TGF-β1表達(dá)的比較 見表2。模型組及各治療組大鼠關(guān)節(jié)滑液中miR-155及TGF-β1的表達(dá)均高于空白組；隨ZFTG劑量的增加，miR-155及TGF-β1的表達(dá)水平均逐漸下調(diào)（P＜0.05）。

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑液中miR-155、TGF-β1表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑液中miR-155、TGF-β1表達(dá)比較（±s）

TGF-β1mRNA TGF-β1蛋白0.75±0.06 1.37±0.12 1.96±0.16* 3.42±0.27*1.45±0.13# 2.19±0.24#ZFTG低劑量組 10 1.68±0.28△組 別 n miR-155空白組 10 0.52±0.04模型組 10 1.89±0.16*陽性對照組 10 1.25±0.12#1.78±0.22△ 2.94±0.40△ZFTG 中劑量組 10 1.49±0.16# 2.02±0.28# 1.17±0.16#ZFTG 高劑量組 10 0.82±0.09#△ 1.49±0.19#△ 0.61±0.05#△

2.3 各組大鼠滑膜組織中TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)比較 見表3。模型組及各治療組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中miR-155的表達(dá)水平均高于空白組；隨ZFTG劑量的增加，miR-155的表達(dá)水平逐漸下調(diào) （P＜0.05）。模型組及各治療組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于空白組；隨ZFTG劑量的增加，TGF-β1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平逐漸下調(diào)（P＜0.05）。

表3 各組大鼠滑膜組織中miR-155基因、TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠滑膜組織中miR-155基因、TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)比較（±s）

TGF-β1mRNA TGF-β1蛋白0.78±0.03 1.68±0.24 1.86±0.06* 3.75±0.32*1.28±0.18# 2.54±0.25*ZFTG低劑量組 10 1.71±0.19△組 別 n miR-155空白組 10 0.69±0.07模型組 10 1.79±0.17*陽性對照組 10 1.19±0.11#1.76±0.15△ 3.39±0.46△ZFTG 中劑量組 10 1.32±0.19# 2.62±0.19# 1.03±0.12#ZFTG 高劑量組 10 1.06±0.23#△ 1.98±0.12#△ 0.81±0.09#△

3 討 論

RA是一種全身性的自身免疫系統(tǒng)疾病，主要臨床表現(xiàn)為慢性全身多關(guān)節(jié)炎癥，其病變往往具有持續(xù)、多發(fā)性及反復(fù)發(fā)作過程，給患者帶來極大痛苦。大量藥理試驗(yàn)及臨床研究［7-10］表明，RA的發(fā)病機(jī)理與血清、關(guān)節(jié)滑液及關(guān)節(jié)滑膜組織中的多種細(xì)胞因子、抗原抗體、轉(zhuǎn)化生長因子、黏附因子及核酸片段等相關(guān)表達(dá)水平關(guān)系密切，但因體內(nèi)各種細(xì)胞因子間存在相互反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，增加了RA病機(jī)研究的難度，目前RA的具體發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。針對RA發(fā)病機(jī)理的不確定性及致病因子的多樣性，臨床的治療手段亦由最初的傳統(tǒng)西藥針對臨床炎癥的治療轉(zhuǎn)變?yōu)獒槍﹃P(guān)節(jié)滑液及滑膜組織中的相關(guān)致病因子的調(diào)節(jié)治療。

ZFTG主要是由制川烏、香附、川芎、麻黃、制草烏等20多味中藥組成的復(fù)方制劑，具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò)、散寒止痛的功效，臨床用于風(fēng)寒濕痹、四肢痹痛及手足麻木等癥。彭紅英等［11］研究表明，ZFTG具有抗炎、鎮(zhèn)痛及免疫抑制的功效，能顯著改善大鼠關(guān)節(jié)腫脹，但其具體的作用機(jī)制并未得到明確闡述。

microRNA （miRNA）是一類非編碼的長約19～24個核苷酸的RNA，其可通過調(diào)控基因的表達(dá)，參與機(jī)體多種生物學(xué)過程［12］。作為其中一個典型的多功能miRNA，越來越多的研究表明miR-155參與體內(nèi)多種細(xì)胞形成、炎癥和免疫反應(yīng)等多種機(jī)體調(diào)節(jié)過程［13］。但針對其在RA調(diào)控方面的作用，目前仍有保護(hù)及促炎兩種觀點(diǎn)［14］。雖有不少文獻(xiàn)報道，miR-155可參與調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的增殖、分化，而產(chǎn)生抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生的作用［15-16］。但目前更多關(guān)于RA的研究表明，miR-155對RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥產(chǎn)生正性反應(yīng)［17］，即顯示出其促炎作用。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中miR-155的表達(dá)水平均顯著高于空白組，與文獻(xiàn)報道其在RA的免疫調(diào)節(jié)中促炎作用相一致，表明miR-155的表達(dá)上調(diào)可能與RA致病機(jī)理有關(guān)。

在參與炎癥反應(yīng)的各種因子中，TGF-β1作為具有雙向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，既可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的活化，又可促進(jìn)血管增生及組織修復(fù)［18］。TGF-β1廣泛分布于機(jī)體的各種組織細(xì)胞，在不同類型的細(xì)胞中其表達(dá)水平及作用均有差異。作為一種重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化的多肽類因子，其表達(dá)水平的高低與RA的發(fā)病過程關(guān)系密切。國外研究表明，RA患者血漿及血清中TGF-β1的水平均高于正常對照組，顯示其表達(dá)水平與炎癥及免疫反應(yīng)的正性調(diào)節(jié)作用［19-21］。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織中TGF-β1的表達(dá)水平均顯著高于空白組，與上述報道一致，表明TGF-β1的表達(dá)上調(diào)可能與RA的致病機(jī)理有關(guān)。

另外本研究結(jié)果顯示，治療28 d后，各治療組大鼠右后足腫脹體積均減小，隨ZFTG劑量的增加，腫脹體積逐漸減小，表明ZFTG可緩解RA大鼠的臨床病癥，且其療效具有劑量相關(guān)性。治療28 d后，各治療組大鼠關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織中miR-155的表達(dá)、TGF-β1mRNA及蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)；且隨ZFTG劑量的增加，miR-155的表達(dá)、TGF-β1蛋白及mRNA的表達(dá)水平均逐漸下調(diào)，此結(jié)果表明表明ZFTG治療RA的作用機(jī)理可能與下調(diào)miR-155、TGF-β1的表達(dá)水平有關(guān)，且ZFTG的下調(diào)效果具有劑量相關(guān)性。

綜上所述，ZFTG可能通過下調(diào)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑液及滑膜組織中miR-155、TGF-β1的表達(dá)等機(jī)制達(dá)到緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床癥狀及治療RA的目的，為其臨床推廣提供理論依據(jù)，亦為RA治療機(jī)理的研究提供參考。

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