黃精多糖與黃酮綜合提取工藝優(yōu)化及硒肥對其含量的影響

滕樹銳+廖璐婧+武蕓+江念+鄭小江

摘要：采用水提醇沉法優(yōu)化黃精（Polygonatum sibiricum）多糖與黃酮的綜合提取工藝，通過調節(jié)不同的硒濃度，分析不同外源硒條件下黃精多糖與黃酮的含量。結果表明，黃精多糖與黃酮最佳綜合提取工藝為料液比1∶70（g∶mL）、提取溫度70 ℃、提取時間1.5 h、微波輔助時間2.5 min，在此工藝條件下，多糖得率186.35 mg/g，黃酮得率為69.54 mg/g。通過調節(jié)不同外源硒的濃度，得出25 mg/kg為黃精富集多糖和黃酮的最佳外源硒濃度。

關鍵詞：黃精（Polygonatum sibiricum）；多糖；黃酮；綜合提?。晃?/p>

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）23-4572-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.23.039

Abstract： The extraction process of Polygonatum Polysaccharide and Polygonatum flavonoids was optimized by water extraction and alcohol precipitation. The content of polysaccharides and flavonoids in Polygonatum was obtained by adjusting different selenium concentrations. The results showed that Polygonatum polysaccharide and Polygonatum flavonoids of optimal synthesis process is：solid-liquid ratio 1∶70（g∶mL）， extraction temperature 70， extraction time 1.5 h， microwave time 2.5 min， under this condition，the rate of 186.35 mg/g polysaccharides，flavonoids was 69.54 mg/g. By adjusting the concentration of different exogenous selenium，it was concluded that 25 mg/kg was the best exogenous selenium concentration for polysaccharides and flavonoids from Polygonatum.

Key words： Polygonatum sibiricum；polysaccharides；flavonoids；comprehensive extraction；selenium

黃精（Polygonatum sibiricum）為百合科（Liliaeea）黃精屬（Polygonatum Mill.）植物[1]。目前，黃精是功能食品、醫(yī)療保健方面不可多得的重要原料之一。研究表明，黃精的主要功能成分是黃精多糖，但也有研究表明黃酮也是其有效成分之一，且總含量也十分可觀[2，3]。黃精多糖的研究已經(jīng)較為深入，研究表明其具有抗腫瘤、抗輻射、改善記憶等作用[4]。黃酮類物質一直是天然產物的研究熱點，其特有的結構使其具有抗氧化、降血糖、調血脂、調節(jié)心血管、預防動脈粥樣硬化等作用[5]。硒是人類必需的微量元素，具有增強免疫力、防治糖尿病、防治心血管疾病、抗癌等功效[6-11]。天然含硒的中藥材，不僅可以有效補充硒含量，而且使中藥具有較高的功能活性，提高中藥材的有效成分，使其具有更高的藥用價值[12，13]。

有學者對黃精多糖和黃酮單一的提取工藝已經(jīng)有所研究[14-16]，但是對多糖和黃酮同時提取的工藝鮮見報道，一種快速、方便、安全、穩(wěn)定的綜合提取方法對黃精的深度開發(fā)具有極大的推動力。硒作為目前科學領域的研究熱點，富硒黃精的研究目前鮮見報道，富硒黃精的研究對黃精產業(yè)和富硒中藥的發(fā)展具有重要意義。本研究采用水提醇沉法優(yōu)化黃精多糖與黃酮的綜合提取工藝，通過調節(jié)不同的硒濃度，得出在不同外源硒的條件下黃精多糖與黃酮的含量，以期為富硒黃精的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：黃精由湖北省農業(yè)科學院中藥材研究所提供，由湖北民族學院鄭小江教授鑒定。

試劑：亞硝酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鈉、石油醚、正丁醇、苯酚、濃硫酸、香草醛、冰醋酸、硝酸鋁均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、FA-1004B型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）、DFY-500型搖擺式高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）、HHS型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司）、TDL-80-2B型低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）、GXZ-9140型數(shù)顯鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.3 方法

1.3.1 綜合提取工藝優(yōu)化 取黃精地下部分于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，過60目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

黃精多糖和黃酮的綜合提取工藝流程：粉碎過的樣品→脫脂處理→微波輔助→溶劑浸提→高速離心→去殘渣取上清液→濃縮→加入高濃度乙醇→低溫靜置24 h→離心→得到上清液a和沉淀b[17]。上清液a→減壓濃縮→冷凍干燥→粗黃酮。沉淀b→加熱水溶解→再加高濃度乙醇沉淀→冷凍干燥→粗多糖。

1.3.2 含量測定 采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[18]，采用鋁鹽顯色法測定總黃酮含量[17]。

1）多糖標準曲線。精確稱取0.4 g葡萄糖標準品，加水溶解后于2 L容量瓶中定容，得到0.2 g/L的葡萄糖標準液。分別取9個100 mL容量瓶，每個容量瓶中放入10～90 mL配制的葡萄糖標準液，加去離子水定容。分別取定容后的溶液1 mL，置于9個25 mL的棕色容量瓶中，9個容量瓶分別加入新制成5%的苯酚溶液1 mL，再迅速加入5 mL濃硫酸，充分搖勻。于室溫冷卻，待溫度恢復常溫后，在490 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，葡萄糖質量濃度為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線[18]。得線性回歸方程為y=9.423x+0.003 1，R2=0.999 7。多糖得率=C1×V1×N1/m1。式中，C1為測得樣品溶液中葡萄糖的質量分數(shù)（mg/mL）；V1為樣品溶液的最終稀釋體積（mL）；N1為稀釋倍數(shù)；m1為樣品質量（g）。

2）黃酮標準曲線。精確稱取0.2 g蘆丁標準品，加乙醇溶解后置于2 L容量瓶中，加水定容，得到0.1 g/L的蘆丁標準品溶液。精密吸取上述標準品溶液1～10 mL分別置于25 mL的棕色容量瓶中，加去離子水5 mL后加入1 mL的5%的NaNO2溶液，搖勻后靜置5 min，再加1 mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻后靜置5 min，再加入4 mL 10%的NaOH溶液，搖勻靜置20 min后，在波長為510 nm處測定各個容量瓶的吸光度，通過吸光度與蘆丁濃度的關系繪制標準曲線，其中濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標[17]。得到線性回歸方程：y=8.542 1x-0.022 3，R2=0.999 4。黃酮得率=C2×V2×N2/m2，式中，C2為測得樣品溶液中黃酮的質量濃度（mg/mL）；V2為樣品溶液的最終稀釋體積（mL）；N2為稀釋倍數(shù)；m2為材料質量（g）。

1.3.3 單因素試驗

1）料液比。稱取材料粉末0.5 g，料液比（g∶mL，下同）1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90，固定提取溫度為60 ℃、提取1 h，微波功率100 W，微波時間2.0 min，提取3次，取平均值得到最佳料液比。

2）提取溫度。稱取材料粉末0.5 g，溫度梯度為40、50、60、70、80、90、100 ℃，固定料液比為1∶60，提取1 h，微波功率100 W，微波時間2.0 min，試驗提取3次，取平均值得到最佳提取溫度。

3）提取時間。稱取材料粉末0.5 g，提取時間梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，固定料液比為1∶60，溫度為60 ℃，微波功率100 W，微波時間2.0 min，試驗提取3次，取平均值得到最佳提取時間。

4）微波時間。稱取材料粉末0.5 g，微波時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 min，固定料液比為1∶60，提取1 h，溫度60 ℃，試驗提取3次，取平均值得到最佳乙醇濃度。

1.3.4 正交試驗設計 選擇料液比、提取溫度、提取時間、微波時間的不同水平進行正交試驗，試驗因素和水平見表1。

1.3.5 硒肥處理試驗 以珍珠巖和蛭石按1∶1混合為固體基質，添加霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)一年生黃精，挑選黃精幼苗使其苗高、塊莖大小、葉片數(shù)等保持一致，不同濃度硒每組為3個重復處理，每個處理為6株。試驗硒濃度梯度為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125 mg/kg[19]。澆足營養(yǎng)液，從處理當日開始，待其生長達到100 d后，按“1.3.1”中所優(yōu)化的方法測定多糖和黃酮含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

整理計算數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件，處理數(shù)據(jù)及方差分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對黃精多糖和黃酮得率的影響 料液比在1∶20～1∶80，黃精多糖得率呈逐漸增長趨勢，當料液比超過1∶80后，多糖得率下降，且在料液比 1∶80和其他處理差異達到顯著水平（P<0.05）；料液比在1∶20～1∶70，黃精黃酮得率呈逐漸增長趨勢，當料液比超過1∶70后，黃酮得率呈緩慢下降趨勢，且料液比1∶50、1∶60、1∶70三個處理差異不顯著（P>0.05）；故設置正交試驗范圍為1∶60、1∶70、1∶80、1∶90。

2.1.2 提取溫度對黃精多糖和黃酮得率的影響 提取溫度在40～70 ℃，黃精多糖得率呈逐漸增長趨勢，當提取溫度超過70 ℃后，多糖得率下降，且在提取溫度40～70 ℃處理差異達到顯著水平（P<0.05）；提取溫度在40～80 ℃，黃精黃酮得率呈逐漸增長趨勢，當溫度超過80 ℃后，黃酮得率呈緩慢下降趨勢，且溫度70～100 ℃ 4個處理差異不顯著（P>0.05），故設置正交試驗范圍為60、70、80、90 ℃。

2.1.3 提取時間對黃精多糖和黃酮得率的影響 提取時間在0.5～1.5 h，黃精多糖得率呈逐漸增長趨勢，當提取時間超過1.5 h后，多糖得率變化不明顯，且1.5～3.0 h時間黃精多糖得率差異不顯著（P>0.05）；提取時間在0.5～1.5 h，黃精黃酮得率呈逐漸增長趨勢，當提取時間超過1.5 h后黃酮得率逐漸下降，且1.5 h處和其他時間點黃精黃酮得率差異達到顯著水平（P<0.05）；故設置正交試驗范圍為1.0、1.5、2.0、2.5 h。

2.1.4 微波時間對黃精多糖和黃酮得率的影響 微波輔助時間在0.5～3.0 min，黃精多糖得率呈逐漸增長趨勢，當微波時間超過3.0 min后，多糖得率急劇下降，且2.5、3.0 min和其他時間點多糖得率差異達到顯著水平（P<0.05）；提取時間在0.5～2.0 min，黃精黃酮得率呈現(xiàn)逐漸增長趨勢，當提取時間超過2.0 min后黃酮得率逐漸下降，且2.0～3.0 min各時間點黃酮得率差異不顯著（P>0.05）；故設置正交試驗范圍為1.5、2.0、2.5、3.0 min。

2.2 正交試驗結果

表2為黃精多糖和黃酮綜合提取工藝正交試驗結果，根據(jù)表2中的結果采用SPSS 19.0軟件進行方法分析，得到表3和表4。

由表3可知，料液比對黃精多糖和黃酮得率的影響均不顯著（P>0.05）。由表4可得，多糖得率料液比大小為A3>A2>A4>A1，黃酮得率料液比大小為A1>A2>A4>A3，綜合得出，最佳料液比為A2，即1∶70。

由表3可知，提取溫度對黃精多糖和黃酮得率均有顯著影響（P<0.05）。由表4可得，多糖得率提取溫度大小為B2>B3>B1>B4，黃酮得率料液比大小為B1>B2>B4>B3，從節(jié)能方面綜合考慮，選擇最佳提取溫度為B2，即70 ℃。

由表3可知，提取時間對黃精多糖有顯著影響（P<0.05），對黃精黃酮得率影響不顯著（P>0.05）。微波輔助時間對黃精多糖有顯著影響（P<0.05），對黃精黃酮得率影響不顯著（P>0.05）。由表4可得，多糖得率提取溫度大小為C2>C3>C4>C1，選擇最佳提取時間為C2，即1.5 h。多糖得率微波時間大小為D3>D4>D2>D1，最佳提取時間為D3，即2.50 min。

2.3 驗證試驗

準確稱取材料5 g，進行3組平行試驗，在A2B2C2D3料液比1∶70、提取溫度70 ℃、提取時間 1.5 h、微波輔助時間2.5 min，所得結果為多糖得率186.35 mg/g，黃酮得率為69.54 mg/g。優(yōu)化出的工藝所得多糖得率高于正交項中任意一項，黃酮得率較A1B3C3D3和A3B3C1D2略低，綜合分析得出，該工藝穩(wěn)定，能較全面地同時提取黃精中的黃酮和多糖。

2.4 不同濃度硒對黃精多糖和黃酮含量的影響

如圖5所示，在施加硒后，黃精多糖含量呈先降低后增加再降低的趨勢。硒濃度在5～15 mg/kg時，硒對黃精多糖含量表現(xiàn)為抑制作用；當硒濃度在20～40 mg/kg時，硒對黃精多糖含量表現(xiàn)為促進作用，且在硒濃度為30 mg/kg時促進作用最為顯著；其后黃精多糖含量隨著硒濃度的增加又表現(xiàn)為抑制作用，且抑制作用逐漸增強。在施加硒后，黃精黃酮含量呈先增加再降低的趨勢，硒濃度在5～25 mg/kg時，硒對黃精黃酮含量的增長表現(xiàn)為促進作用；當硒濃度達到25 mg/kg后，隨著硒濃度的增加，黃精黃酮含量表現(xiàn)為抑制作用，且抑制作用逐漸增強。

3 結論與討論

對料液比、提取溫度、提取時間、微波輔助時間4個因素進行單因素和正交試驗，得出黃精多糖和黃酮的最佳綜合提取工藝為料液比1∶70、提取溫度70 ℃、提取時間1.5 h、微波輔助時間2.5 min，在此工藝條件下，多糖得率186.35 mg/g，黃酮得率為69.54 mg/g。通過調節(jié)不同外源硒的濃度，得出25 mg/kg為黃精富集多糖和黃酮的最佳外源硒濃度。

本試驗在傳統(tǒng)提取工藝過程中加入了微波輔助法，得出的工藝穩(wěn)定，具有一定的高效性，且提取溶劑為水，即成本低廉又不污染環(huán)境。提取率黃精多糖的得率和提取溫度、提取時間、微波輔助時間關系比較密切，在單一提取黃精多糖的過程中應注意對這3個因素的控制；黃精黃酮的得率和提取溫度比較密切，在單一提取過程中應注意對溫度的控制。

施加外源硒對黃精有效成分的影響總體表現(xiàn)為低濃度影響不顯著，中濃度具有一定的促進作用，高濃度具有很強的抑制作用，這說明不同濃度的硒能在不同水平上影響黃精的次生代謝過程，從而影響有效成分的富集。高濃度條件下表現(xiàn)為顯著的抑制作用，可能是硒濃度過高對植物體產生了傷害，影響其正常的生長發(fā)育。故在處理富硒中藥材和富硒農作物的過程中，不能一味追求植物對硒含量的吸收，對有效成分的富集和植物相應的生長發(fā)育也是其重要的考察因素。

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