回腸轉(zhuǎn)位術對2型糖尿病大鼠血糖及腸道屏障的影響及機制研究

蔡遜 王世杰 馬丹丹 傅濤 劉勇 孫康

·論 著·(實驗研究)

回腸轉(zhuǎn)位術對2型糖尿病大鼠血糖及腸道屏障的影響及機制研究

蔡遜 王世杰 馬丹丹 傅濤 劉勇 孫康

目的觀察回腸轉(zhuǎn)位術(ileal transposition, IT)對2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)、胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like peptide-2, GLP-2)、D乳酸及二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)的影響，探討IT對T2DM大鼠血糖和腸黏膜屏障的影響及相關機制。方法隨機數(shù)字表法將60只T2DM大鼠分為IT組和假手術組(Sham組)，每組30只。觀察并測定兩組大鼠術前及術后3d、1周(w)、2w、4w、6w、8w FBG、GLP-1、GLP-2、D乳酸、DAO水平的變化。結(jié)果與術前比較，IT組T2DM大鼠術后3d FBG、GLP-1及GLP-2差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，術后1w、2w、4w、6w、8w FBG明顯下降(t1w=6.148,P1w<0.001 ;t2w=8.650,P2w<0.001 ;t4w=9.569,P4w<0.001;t6w=11.201,P6w<0.001;t8w=12.424,P8w<0.001)，GLP-1及GLP-2均顯著升高[(GLP-1:t1w=-12.794,P1w<0.001;t2w=-18.477,P2w<0.001;t4w=-24.252,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001)、 (GLP-2:t1w=-12.305,P1w<0.001;t2w=-14.708,P2w<0.001;t4w=-28.142,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001)]。與術前相比，IT組術后3 d DAO及D-乳酸均較術前明顯升高(DAO:t3d=-46.223,P3d<0.001；D-乳酸:t3d=-6.439,P3d<0.001)，但術后1w、2w、4w、6w、8w DAO及D-乳酸與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。相同條件下，Sham組上述指標均未見明顯變化(P>0.05)。結(jié)論IT通過刺激GLP-1和GLP-2分泌增加來發(fā)揮降低血糖和保護腸道屏障功能的作用。

回腸轉(zhuǎn)位術； 2型糖尿??； 大鼠； 胰高血糖素樣肽； 腸道屏障

胃腸道除消化、吸收、分泌功能及免疫調(diào)節(jié)外，還具有重要的屏障功能[1]。在正常情況下，人體腸黏膜能有效阻止腸道內(nèi)細菌、毒素及有害物質(zhì)侵入體內(nèi)[2]。但在手術、創(chuàng)傷、休克、嚴重感染、膿毒癥等應激情況下，胃腸道黏膜易受到攻擊和損害而發(fā)生屏障功能障礙[3]。一般情況下，2型糖尿病(lype 2 diabetes mellitus, T2DM)大鼠在回腸轉(zhuǎn)位術(ileal transposition, IT)這一手術應激情況下，胃腸道黏膜易受損而發(fā)生屏障功能障礙，但是國內(nèi)外卻未見相關報道。因此我們推測：IT可能通過其他方式保護T2DM大鼠的腸黏膜屏障功能?；谝陨贤茰y及本課題組前期研究的基礎[4-5]，我們選擇T2DM大鼠模型進行回腸轉(zhuǎn)位術手術干預，旨在分析回腸轉(zhuǎn)位術對大鼠的降糖效果作用，并通過分析手術前后胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)的變化，探討其可能的機制，以期為IT進一步臨床應用提供理論和實踐依據(jù)。更為重要的是通過觀察IT對胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like peptide-2, GLP-2)、D乳酸及二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)的影響，探討IT對T2DM大鼠腸黏膜屏障的影響及機制。

材料與方法

一、實驗動物的購買、飼養(yǎng)、模型建立及分組

SPF級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠60只，6周齡，體重180～200 g，購于武漢大學動物實驗中心，室內(nèi)通風良好，室溫20 ℃～25 ℃，相對濕度40%～70%，每日光照12 h，自由攝食飲水。建模方法參考文獻[6-7]報道：高脂高糖喂養(yǎng)4周(w)，腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ) 35 mg/kg。注射后3 d尾靜脈測大鼠血糖，以空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)值≥16.7 mmol/L，并穩(wěn)定10 d，為大鼠造模成功。T2DM大鼠模型隨機分為2組，分別為：IT組和假手術組(Sham組)，每組30只大鼠以1～30隨機編號。

二、手術分組及處理

兩組糖尿病大鼠術前禁食不禁水12 h，均用10%水合氯醛按0.5 ml/100 g體重進行腹腔注射麻醉。仰臥位固定四肢及頭部，用聚維酮碘(碘伏)常規(guī)消毒鋪巾，于上腹部正中切口進腹，切口長3～4 cm。①IT組：自回盲部近端5～10 cm處截取約6～10 cm回腸段，保留小腸系膜，距屈氏韌帶5～10 cm橫斷空腸，將所截取回腸段按原來的蠕動方向做兩個端端吻合間置于橫斷的空腸中間。吻合完畢，生理鹽水沖洗腹腔，逐層關腹。吻合腸管使用6-0的可吸收縫線連續(xù)縫合，吻合口前層和后層漿肌層包埋各兩針，關腹使用4-0的絲線縫合。詳見圖1。②假手術組：僅行腹壁切開縫合術。

三、觀測指標及方法

手術當天禁食禁水，術后第1天禁食不禁水，術后第2天恢復術前的飲食。測量術前及術后3d、1w、2w、4w、6w、8w回腸轉(zhuǎn)位組和假手術組的FBG、GLP-1、GLP-2、DAO和D-乳酸水平。2組大鼠隔夜禁食12 h，斷尾或眼球摘除取血1.0 ml，血糖儀檢測FBG，靜置離心，分離血清按照ELISA試劑盒說明書對GLP-1、GLP-2、DAO和D-乳酸數(shù)值進行檢測。

A.上腹部正中切口進腹;B.截取約6cm回腸;C.端端吻合圖1 回腸轉(zhuǎn)位術

表1 不同時間兩組大鼠FBG、GLP-1及GLP-2水平比較±s)

注：與術前比較，*P<0.001

四、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、兩組大鼠的FBG、GLP-1及GLP-2水平比較

同組內(nèi)與術前比較，IT組大鼠術后3d FBG、GLP-1及GLP-2差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，術后1w、2w、4w、6w、8w FBG較術前顯著下降(t1w=6.148,P1w<0.001;t2w=8.650,P2w<0.001;t4w=9.569,P4w<0.001;t6w=11.201,P6w<0.001;t8w=12.424,P8w<0.001)、GLP-1及GLP-2均顯著升高(GLP-1:t1w=-12.794,P1w<0.001;t2w=-18.477,P2w<0.001;t4w=-24.252,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001；GLP-2:t1w=-12.305,P1w<0.001;t2w=-14.708,P2w<0.001;t4w=-28.142,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001)。見表1。

二、兩組大鼠的血漿DAO及D-乳酸水平比較

術前2組大鼠空腹D-乳酸及DAO差異無統(tǒng)計學意義。與術前相比，IT組術后3 d DAO及D-乳酸均較術前明顯升高(DAO:t=-46.223,P<0.001)、(D-乳酸:t=-6.439,P<0.001)，術后1w、2w、4w、6w、8wDAO及D-乳酸與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義。相同條件下，Sham組卻無此變化。見表2。

表2 不同時間兩組大鼠DAO及D-乳酸水平比較±s)

注：與術前比較，*P<0.001

討 論

Pories等[8]于1995年報道稱胃轉(zhuǎn)流術對T2DM病人的血糖具有顯著的改善作用，且無需采取任何降糖措施維持，開創(chuàng)外科手術治療T2DM的新途徑。近年來，隨著手術治療糖尿病研究的不斷深入，越來越多的新術式不斷涌現(xiàn)，目前，國外學者通過對T2DM大鼠進行IT，取得了良好的降糖效果[9-10]。但該術式的有效性、安全性、性價比、應用前景和進一步的臨床應用等仍需進一步研究論證。因此本研究旨在探討IT對T2DM大鼠的降糖作用和對腸黏膜屏障的影響及相關機制。

IT術式操作簡單，既不縮減消化道容量，也不改變消化道長度和胃腸道延續(xù)性，只是通過調(diào)整腸道排序來調(diào)節(jié)機體的生理代謝，幾乎避免了其他減重代謝術式帶來的各種并發(fā)癥。被譽為是最符合代謝外科設計理念的手術方式[11]。IT可使未完全消化的食物提前進入回腸，食物持續(xù)不斷刺激大鼠腸道L細胞分泌GLP-1和GLP-2。研究[12]認為腸-胰島素軸中控制T2DM最核心的介導因子即是GLP-1。GLP-1由30個氨基酸組成，是一種末端空回腸L細胞分泌的腸肽激素。其主要的生理功能為減少食物吸收，抑制胃動力、胃酸分泌及胃排空，抑制胰高血糖素分泌，促進胰島β細胞增生及胰島素合成與分泌。本研究中，術后1w、2w、4w、6w、8w FBG較術前顯著下降，GLP-1顯著升高。結(jié)果表明：IT對T2DM大鼠有顯著的降糖作用，其可能的機制是食物提前進入回腸，刺激GLP-1分泌增加，增加胰島素分泌。與國內(nèi)外研究結(jié)果相一致[13-14]。

哺乳動物的組織在正常情況下既不產(chǎn)生也不代謝D-乳酸，但在腸道應激(如手術、缺血、創(chuàng)傷、感染等)情況下，腸黏膜屏障通透性迅速增高，血中D-乳酸蓄積。故血漿D-乳酸作為腸黏膜屏障通透性的標志物，直接反映腸黏膜通透性和屏障功能的損害程度[15-16]。血漿DAO是人類和所有哺乳動物腸黏膜細胞胞質(zhì)中具有高度活性的細胞內(nèi)酶。當腸黏膜細胞受損壞死時，DAO即刻釋放入血，導致血中活性增高。因此血DAO水平是監(jiān)測腸黏膜損傷的較好指標[17]。本研究中，IT組術后3 d DAO及D-乳酸均較術前明顯升高，術后1w、2w、4w、6w、8w DAO及D-乳酸與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明IT術后3d造成2型糖尿病大鼠腸黏膜受損而發(fā)生屏障功能障礙，但是隨著時間的推移，腸道屏障功能得以恢復，具體機制不明。GLP-2屬于胰高血糖素原衍生肽類，是一種由33個氨基酸組成的單鏈多肽，作用僅限于腸道，具有器官特異性。其主要由腸道L細胞合成、分泌，通過腎臟排泄。而腸道L細胞主要集中于回腸和結(jié)腸，其分泌受飲食、神經(jīng)和內(nèi)分泌等多種因素調(diào)節(jié)[18-19]。GLP-2主要功能有：增加腸道血供，促進腸黏膜生長，抑制腸上皮細胞凋亡，增加黏膜己糖的轉(zhuǎn)運及消化酶的表達，進而降低腸道通透性，從而達到保護腸道屏障功能的作用[20-21]。本研究中IT組術后1～8w GLP-2較術前顯著增加。由此可見回腸轉(zhuǎn)位術使食物提前進入回腸，持續(xù)不斷刺激GLP-2分泌，GLP-2表達增加可來保護腸道屏障功能。

綜上所述，IT通過調(diào)控GLP-1和GLP-2的表達來發(fā)揮降低血糖和保護腸道屏障功能的作用。相信隨著科研工作者不斷深入地探討和研究，IT進一步應用到臨床，將使廣大T2DM病人獲益。

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Effectofilealtranspositionsurgeryonbloodglucoseandintestinalbarrierinratswithtype2diabetesmellitusandpossiblemechanism

CaiXun,WangShijie,MaDandan,FuTao,LiuYong,SunKang.

DepartmentofGeneralSurgery,WuhanGeneralHospitalofPeople'sLiberationArmy,Wuhan430070,China

FuTao,Email:surgfu@sina.com

ObjectiveTo observe the effect of ileal transposition(IT) surgery on fasting blood glucose(FBG), glucagon-like peptide-1(GLP-1), glucagon-like peptide-2(GLP-2), D lactate and diamine oxidase(DAO) expression, and intestinal barrier in type 2 diabetes mellitus(T2DM) rats and the possible mechanisms.MethodsT2DM rats were randomly divided into IT surgery group(n=30) and sham operation group(n=30). The FBG, GLP-1, GLP-2, D lactate and DAO levels in the two groups were determined before and 3 days, 1 week, 2 weeks, 4 weeks, 6 weeks, 8 weeks after operation.ResultsThere was no significant difference in FBG, GLP-1 and GLP-2 before and at 3rd day after operation in IT group(P>0.05). FBG levels were significantly decreased (t1w=6.148,P1w<0.001;t2w=8.650,P2w<0.001;t4w=9.569,P4w<0.001;t6w=11.201,P6w<0.001;t8w=12.424,P8w<0.001),and GLP-1 and GLP-2 levels were significantly increased at 1w, 2w, 4w, 6w, 8w in IT group[(GLP-1:t1w=-12.794,P1w<0.001;t2w=-18.477,P2w<0.001;t4w=-24.252,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001) and (GLP-2:t1w=-12.305,P1w<0.001;t2w=-14.708,P2w<0.001;t4w=-28.142,P4w<0.001;t6w=-27.378,P6w<0.001;t8w=-40.056,P8w<0.001)]. As compared with preoperation, D lactate and DAO levels were significantly increased at 3rd day after operation in IT group[(DAO:t3d=-46.223,P3d<0.001); (D lactate:t3d=-6.439,P3d<0.001)]. There was no significant difference in D lactate and DAO levels before and at 1w, 2w, 4w, 6w, 8w after operation in IT group(P>0.05). Under the same conditions, there were no obvious changes in the above indexes in sham group(P>0.05).ConclusionsIT surgery has a significant hypoglycemic effect and can protect intestinal barrier function by stimulating the secretion of GLP-1 and GLP-2.

Ileal transposition; Type 2 diabetes mellitus; Rats; Glucagon-like peptidel; Intestinal barrier

R657.7; R587.1

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2017.06.019

湖北省衛(wèi)生計生委科研項目(WJ2017H0048, WJ2017H0043)

430070 武漢，中國人民解放軍武漢總醫(yī)院普通外科(蔡遜、馬丹丹、傅濤、劉勇、孫康)；南方醫(yī)科大學中國人民解放軍總醫(yī)院(王世杰)

傅濤，Email：surgfu@sina.com

10.16151/j.1007-810x.2016.05. 001.

2017-06-12)