維拉帕米介導(dǎo)食管癌細(xì)胞多藥耐藥及細(xì)胞凋亡的實驗研究

翁呈韜, 張騰躍, 劉亞貝, 樊高飛, 吳 旸 ,范平生

(安徽省腫瘤醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科, 安徽 合肥, 230031)

論著

維拉帕米介導(dǎo)食管癌細(xì)胞多藥耐藥及細(xì)胞凋亡的實驗研究

翁呈韜, 張騰躍, 劉亞貝, 樊高飛, 吳 旸 ,范平生

(安徽省腫瘤醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科, 安徽 合肥, 230031)

目的探討維拉帕米提高食管癌化療藥物敏感性及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的影響。方法采用CCK-8法檢測紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶對于4種食管癌細(xì)胞系(EC109、EC9706、KYSE-450、TE-1)的IC50值(IC501); 用維拉帕米(4.91 μg/mL)聯(lián)合上述化療藥物處理每種細(xì)胞, CCK8法檢測維拉帕米聯(lián)合上述化療藥物針對上述4種食管癌細(xì)胞株(EC109, EC9706, KYSE-450和TE-1) IC50值(IC502); 以前期實驗得出的VER逆轉(zhuǎn)化療耐藥能力差異最為顯著的一對食管癌細(xì)胞為研究對象, Annexin V-PI雙染法檢測食管癌細(xì)胞凋亡。結(jié)果紫杉醇在KYSE-450和EC9706的IC50值明顯大于EC109和TE-1, 順鉑在TE-1細(xì)胞中IC50值明顯小于其他3種細(xì)胞, 5-氟尿嘧啶在EC109中IC50值明顯高于在其他3種細(xì)胞。加用維拉帕米后, 4種食管癌細(xì)胞系(EC109, EC9706, KYSE-450和TE-1)針對紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶的IC50值均不同程度下降，提示維拉帕米均不同程度提高了上述3種化療藥物的敏感性。其中，順鉑組未加入維拉帕米前, EC109, EC9706, KYSE-450與TE-1相比，均存在不同程度耐藥性，加入維拉帕米后，針對EC9706 IC50值變化倍數(shù)較大(15.2倍)，提示逆轉(zhuǎn)敏感; 針對EC109IC50值變化倍數(shù)較小(1.6倍)，提示逆轉(zhuǎn)耐受。結(jié)論維拉帕米逆轉(zhuǎn)EC9706的阿霉素效率指數(shù)最高(15.2倍)，與EC109細(xì)胞相比有顯著性差異(1.6倍)。提示EC9706(DDP)對維拉帕米的逆轉(zhuǎn)敏感，而EC109(DDP)對維拉帕米的逆轉(zhuǎn)耐受。維拉帕米有可能通過促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡途徑提高其逆轉(zhuǎn)化療耐受的能力，從而增強化療藥物敏感性。

維拉帕米; 食管癌; 耐藥性; 逆轉(zhuǎn)能力; 細(xì)胞凋亡

食管癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一, 50%～60%的患者已為晚期腫瘤, 5年生存率僅為14%, 若存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其1年內(nèi)總體生存率不足50%[1]。晚期食管癌患者多釆用化療、放療結(jié)合手術(shù)的綜合治療，化療在其中起著重要的作用[2]?，F(xiàn)有的化療藥物主要包括順鉑、5-氟尿嘧啶、紫杉類、去甲長春新堿、依立替康、希羅達(dá)等，多采用聯(lián)合化療的方法[3-4]。維拉帕米是一種臨床用于心臟疾患的鈣離子通道阻滯劑，研究[5-6]表明其具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(MDR)的作用。為探討維拉帕米逆轉(zhuǎn)食管癌細(xì)胞的化療耐藥性，本研究擬通過檢測維拉帕米改變3種化療藥物(紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶)對4種食管癌細(xì)胞株(EC109、EC9706、KYSE-450、TE-1)的IC50值的影響，篩選出維拉帕米逆轉(zhuǎn)敏感和逆轉(zhuǎn)耐受細(xì)胞株及對應(yīng)用的化療藥物，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實驗材料

食管癌細(xì)胞株(EC109、EC9706、KYSE-450、TE-1)由本科實驗室留存; 紫杉醇(PTX, 揚子江藥業(yè), 60 mg/支)，順鉑(DDP,江蘇豪森, 30 mg/支), 5-氟尿嘧啶(5-FU, 江蘇南通精華制藥, 0.25 g/10 mL), 維拉帕米(Verapamil, 上海禾豐制藥, 5 mg/2 mL), 由本院藥劑科提供; CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所; V-PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購自武漢碧云天生物科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng): 人食管癌細(xì)胞株以含10%FCS的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，用0.25%胰酶消化處理對數(shù)生長期的人食管癌細(xì)胞株細(xì)胞, 24 h換液，當(dāng)細(xì)胞呈單層致密狀分布時，用PBS沖洗, 0.25%胰蛋白酶消化后以1∶3傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 化療藥物及維拉帕米給藥濃度: 化療藥物進(jìn)行1∶4或1∶5稀釋，5-FU終濃度設(shè)置為200、40、8、1.6和0.32 μg/mL; DDP設(shè)置為0.25、1、4、16、64 μg/mL; 紫杉醇為0.25、1、4、16、64 μg/mL; 維拉帕米設(shè)置為1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 μg/mL 的5個濃度梯度。

1.2.3 4種食管癌細(xì)胞系化療藥物耐藥特性的測定: 取對數(shù)生長期食管癌細(xì)胞 , 0.25%胰酶消化后用高糖DMEM制成單細(xì)胞懸液, 2×105個/mL細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中(100 μL/孔)，置37 ℃, 5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。加入用高糖DMEM稀釋的不同濃度的化療藥物，每個劑量設(shè)3個復(fù)孔(對照組分為PBS處理組和空白對照組)，培養(yǎng)72 h后，再加入CCK8試劑(10 μL/孔)，培養(yǎng)1 h后，以PBS處理組為對照，測定每組的OD450值，以藥物濃度為橫軸, OD450為縱軸，繪制濃度-效應(yīng)曲線，確定半數(shù)抑制濃度(IC501)。實驗至少重復(fù)3次。

1.2.4 維拉帕米逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥實驗: 用固定濃度的維拉帕米(4.91 μg/mL)聯(lián)合化療藥物處理每種細(xì)胞, CCK8法檢測該化療藥物針對4種食管癌細(xì)胞系(EC109、EC9706、KYSE-450、TE-1) IC50值(IC502)。

1.2.5 維拉帕米逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥能力判定: 維拉帕米逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥效率指數(shù)，以IC501/IC502結(jié)果判定，值越大說明能力越強。

1.2.6 Annexin V-PI雙染法檢測食管癌細(xì)胞凋亡率: 本研究以實驗步驟1.2.5得出的VER逆轉(zhuǎn)ADM化療耐藥能力差異最為顯著的一對食管癌細(xì)胞為對象進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，每個細(xì)胞分成4組，即正常組(NC)、單用VER組(VER)、單用化療藥物組、VER聯(lián)合化療藥物組，考慮化療藥物毒性及后續(xù)實驗，化療藥物劑量選擇該細(xì)胞株IC501值1/5倍濃度，VER劑量4.91 μg/mL。

采用10%FBS的RMPI-1640在6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞24 h至匯合度為70%左右，胰酶消化后用10%FBS的培養(yǎng)基終止胰酶作用, 1 000 r/min、4 ℃離心5 min, 并用預(yù)冷的PBS清洗2次，將細(xì)胞重懸于100 μL binding buffer, 再加入 2 μL的 Annexin V-FITC, 混勻，避光于冰上放置15 min, 加入400 μL PBS，每個樣品在臨上流式細(xì)胞儀前再加1 μL的PI溶液，吹勻后迅速檢測食管癌細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

連續(xù)型變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)描述，數(shù)據(jù)分析采用Excel (Microsoft, Redmond, WA) 或者 Prism (Prism 4.0, GraphPad Inc, La Jolla, CA, USA)進(jìn)行單因素方差分析或者M(jìn)ann-Whitney U檢驗，實驗均重復(fù)3次以上,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義

2 結(jié) 果

2.1 4種食管癌細(xì)胞系對紫杉醇、順鉑、5-氟尿 嘧啶耐藥性判定的分析

作者通過CCK-8分析法對4種食管癌細(xì)胞系(EC109、EC9706、KYSE-450、TE-1)對3種化療藥物(紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶)IC50實驗結(jié)果顯示，紫杉醇在KYSE-450和EC9706的IC50值明顯大于EC109和TE-1, 順鉑在TE-1細(xì)胞中IC50值明顯小于其他3種細(xì)胞, 5-氟尿嘧啶在EC109中IC50值明顯高于在其他3種細(xì)胞。KYSE-450和EC9706對紫杉醇耐藥性大于EC109和TE-1; BEL-EC9706、EC109、KYSE-450對順鉑耐藥性大于TE-1, EC109對5-氟尿嘧啶耐藥性顯著大于其他3種細(xì)胞。見表1、2。

表1 3種化療藥物對4種食管癌細(xì)胞系IC501值

表2 3種化療藥物對4食管癌細(xì)胞系IC50相對值

2.2 3種化療藥物分別聯(lián)合維拉帕米逆轉(zhuǎn)食管 癌細(xì)胞化療耐藥特性的判定

為了研究維拉帕米逆轉(zhuǎn)食管癌耐藥性的機制，作者需要選擇維拉帕米逆轉(zhuǎn)效果最好的食管癌細(xì)胞系及對應(yīng)的化療藥物作為研究對象。因此，作者用固定濃度的維拉帕米(4.91 μg/mL)聯(lián)合化療藥物處理每種細(xì)胞, CCK8法檢測固定濃度的維拉帕米聯(lián)合化療藥物針對4種食管癌細(xì)胞系(EC109, BEL-EC9706, KYSE-450和TE-1) IC50值。研究發(fā)現(xiàn)，加用維拉帕米后, 4種食管癌細(xì)胞系(EC109, BEL-EC9706, KYSE-450和TE-1)針對紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶的IC50值均不同程度下降，提示維拉帕米均不同程度提高了上述3種化療藥物的敏感性。見表3。

表3 維拉帕米(4.91 μg/mL)聯(lián)合化療藥物對4食管癌細(xì)胞系IC502值

2.3 維拉帕米逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥能力判定

維拉帕米逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥效率指數(shù)，以IC501/IC502結(jié)果判定，值越大說明能力越強。其中，順鉑組未加入維拉帕米前, EC109, EC9706, KYSE-450與TE-1相比，均存在不同程度耐藥性; 加入維拉帕米后，針對BEL-EC9706 IC50值變化倍數(shù)較大(15.2倍)，提示逆轉(zhuǎn)敏感; 針對EC109IC50值變化倍數(shù)較小(1.6倍)，提示逆轉(zhuǎn)耐受。結(jié)果表明，維拉帕米逆轉(zhuǎn)EC9706的順鉑效率指數(shù)最高(15.2倍)，與EC109細(xì)胞相比有顯著差異(1.6倍)。提示BEL-EC9706(順鉑)對維拉帕米的逆轉(zhuǎn)敏感，而EC109(順鉑)對維拉帕米的逆轉(zhuǎn)耐受。見表4。

表4 維拉帕米逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥效率指數(shù)(IC501/IC502)

2.4 Annexin V-PI雙染法檢測食管癌細(xì)胞凋亡

本研究以實驗2.3得出的VER逆轉(zhuǎn)順鉑化療耐藥能力差異最為顯著的一對食管癌細(xì)胞(EC109和EC9706)為研究對象檢測食管癌細(xì)胞凋亡，如圖1所示，針對EC109細(xì)胞，NC組、VER組、DDP組、VER+DDP組細(xì)胞凋亡分別為2.1%、4%、15.4%、18.6%; 針對EC9706細(xì)胞, NC組、VER組、DDP組、VER+DDP組細(xì)胞凋亡分別為0.1%、3.1%、12.5%、22.1%。如圖2所示，與NC組相比, VER組細(xì)胞凋亡率無顯著差異(P>0.05); 針對EC109細(xì)胞, DDP組與VER+DDP組相比，細(xì)胞凋亡率有顯著差異(P<0.05), 針對EC9706細(xì)胞, DDP組與VER+DDP組相比，細(xì)胞凋亡率有顯著差異(P<0.01)。這說明，維拉帕米有可能通過促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡途徑提高其逆轉(zhuǎn)化療耐受的能力，從而增強化療藥物敏感性。

圖1 AnnexinV-PI雙染法檢測食管癌細(xì)胞凋亡

圖2 兩種食管癌細(xì)胞凋亡率測定

3 討 論

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[7], 中國則是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，每年新發(fā)病例約25萬，占全世界新發(fā)病例的50%以上[8]。目前化療是晚期食管癌最主要的治療手段之一，但化療過程中出現(xiàn)的多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象嚴(yán)重影響了臨床的化療效果。作者通過CCK-8分析法對4種食管癌細(xì)胞系(EC109、EC9706、KYSE-450、TE-1)對3種化療藥物(紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶)IC50實驗結(jié)果顯示，紫杉醇在KYSE-450和EC9706的IC50值明顯大于EC109和TE-1, 順鉑在TE-1細(xì)胞中IC50值明顯小于其他3種細(xì)胞, 5-氟尿嘧啶在EC109中IC50值明顯高于在其他3種細(xì)胞。KYSE-450和EC9706對紫杉醇耐藥性大于EC109和TE-1; EC9706、EC109、KYSE-450對順鉑耐藥性大于TE-1, EC109對5-氟尿嘧啶耐藥性顯著大于其他3種細(xì)胞。這說明，食管癌細(xì)胞對不同化療藥物存在不同程度的耐藥性。

維拉帕米靜脈應(yīng)用導(dǎo)致的心血管毒性限制了其作為一種逆轉(zhuǎn)化療耐藥的藥物的臨床應(yīng)用，我課題組通過動脈介入灌注維拉帕米聯(lián)合化療藥物，明顯提高了臨床療效，且未見明顯心血管毒副反應(yīng)，但仍有部分患者療效欠佳[9-13], 這說明，不同患者對維拉帕米的治療反應(yīng)是不同的，這可能與維拉帕米逆轉(zhuǎn)不同食管癌細(xì)胞的能力有明顯差異相關(guān)。本研究以4種食管癌細(xì)胞株為研究對象，開展維拉帕米提高食管癌細(xì)胞的化療敏感性的研究。研究[14-16]發(fā)現(xiàn)，加用維拉帕米后, 4種食管癌細(xì)胞系(EC109, EC9706, KYSE-450和TE-1)針對紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶的IC50值均不同程度下降，提示維拉帕米均不同程度提高了上述3種化療藥物的敏感性。其中，順鉑組未加入維拉帕米前, EC109, EC9706, KYSE-450與TE-1相比，均存在不同程度耐藥性，加入維拉帕米后，針對BEL-EC9706 IC50值變化倍數(shù)較大(15.2倍)，提示逆轉(zhuǎn)敏感; 針對EC109 IC50值變化倍數(shù)較小(1.6倍)，提示逆轉(zhuǎn)耐受。結(jié)果表明，維拉帕米逆轉(zhuǎn)EC9706的順鉑效率指數(shù)最高(15.2倍)，與EC109細(xì)胞相比有顯著性差異(1.6倍)。提示BEL-EC9706(順鉑)對維拉帕米的逆轉(zhuǎn)敏感，而EC109(順鉑)對維拉帕米的逆轉(zhuǎn)耐受。

為進(jìn)一步探討維拉帕米提高化療藥物敏感性可能機制，作者以VER逆轉(zhuǎn)順鉑化療耐藥能力差異最為顯著的一對食管癌細(xì)胞(EC109和EC9706)為研究對象檢測食管癌細(xì)胞凋亡，針對EC109細(xì)胞, NC組、VER組、DDP組、VER+DDP組細(xì)胞凋亡分別為2.1%、4%、15.4%、18.6%; 針對EC9706細(xì)胞, NC組、VER組、DDP組、VER+DDP組細(xì)胞凋亡分別為0.1%、3.1%、12.5%、22.1%。針對EC109細(xì)胞, DDP組與VER+DDP組相比，細(xì)胞凋亡率有顯著性差異(P<0.05), 針對EC9706細(xì)胞, DDP組與VER+DDP組相比，細(xì)胞凋亡率有顯著性差異(P<0.01), 這說明，維拉帕米有可能通過促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡途徑提高其逆轉(zhuǎn)化療耐受的能力，從而增強化療藥物敏感性。

總之，維拉帕米逆轉(zhuǎn)EC9706的順鉑效率指數(shù)最高(15.2倍)，與EC109細(xì)胞相比有顯著性差異(1.6倍)。提示EC9706(DDP)對維拉帕米的逆轉(zhuǎn)敏感，而EC109(DDP)對維拉帕米的逆轉(zhuǎn)耐受。維拉帕米有可能通過促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡途徑提高其逆轉(zhuǎn)化療耐受的能力，從而增強化療藥物敏感性。

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Experimentalstudyofverapamilmediatedapoptosisofesophagealcancercellsandmulti-drugresistance

WENGChengtao,ZHANGTengyue,LIUYabei,FANGaofei,WUYang,FANPingsheng

(DepartmentofOncology,AnhuiTumorHospital,Hefei,Anhui, 230031)

ObjectiveTo investigate the effect of verapamil on chemosensitivity and apoptosis of esophageal cancer cells.MethodsThe IC50values(IC501) of three kinds of chemotherapy drugs: paclitaxel, cisplatin, and 5-fluorouracil were detected by CCK-8 method in 4 kinds of esophageal cancer cell lines (EC109, EC9706, KYSE-450, TE-1). Each cell was processed by verapamil (4.91 μg/mL) combined with the chemotherapy treatment above, IC50(IC502) value was detected by CCK8 assay combined with chemotherapy for the verapamil of the 4 esophageal carcinoma cell lines (EC109, EC9706, KYSE-450 and TE-1). A pair of esophageal cancer cells with the most significant reversal of the resistance to chemotherapy by VER detected by the previous experiments were included as research objects, and Annexin V-PI double staining method was used to detect the apoptosis of esophageal cancer cells.ResultsThe IC50values of paclitaxel in KYSE-450 and EC9706 cell lines were significantly higher than that in EC109 and TE-1. The IC50values of cisplatin in TE-1 cells were significantly less than those in the other three cells, while the IC50values of 5-fluorouracil in EC109 were significantly higher than that in other three cell lines. After adding verapamil, the IC50values of paclitaxel, cisplatin and 5-fluorouracil in four esophageal cancer cell lines (EC109, EC9706, KYSE-450 and TE-1) all decreased to different degrees, and the above three kinds of chemotherapeutic drugs had increased their sensitivity to varying degrees. Among them, the cisplatin group before adding verapamil had different degrees of resistance compared with EC109, EC9706, KYSE-450, TE-1. After joining verapamil, IC50value change for the EC9706 multiplied for 15.2 times, suggesting that the reversal was sensitive; IC50value change for EC109 was 1.6 times smaller, suggesting that the reversal was tolerant.ConclusionVerapamil reversal of EC9706 adriamycin has highest efficiency index (15.2 times), there was significant difference compared with the EC109 cells (1.6 times). Tipthe EC9706 (DDP) sensitivity to the reversal of verapamil, and EC109 (DDP) reverse resistance of verapamil. Verapamil may enhance the ability to reverse chemotherapy tolerance by promoting cell apoptosis, thereby enhancing the sensitivity of chemotherapeutic drugs.

verapamil; esophageal cancer; drug resistance; reversal ability, apoptosis

2017-07-20

國家自然基金(81172364, 81201576); 安徽省自然科學(xué)基金(1408085MH211);安徽省衛(wèi)生廳重點科研項目(2010A006)

范平生

R 735.1

A

1672-2353(2017)24-001-05

10.7619/jcmp.201724001