原發(fā)性腎病綜合征患兒腎組織P-gp170蛋白和mRNA表達(dá)與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系

劉廣濤 關(guān)鳳軍 董 晨

摘? ?要：目的? 觀察原發(fā)性腎病綜合征患兒腎組織中P-糖蛋白170的表達(dá)，分析腎組織中P-gp170表達(dá)與臨床和病理的關(guān)系，探討P-gp170表達(dá)在PNS 患兒GC耐藥中的作用。方法? 采用腎活檢術(shù)取得96例處于不同病程的PNS患兒腎組織標(biāo)本，進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)診斷和腎臟病理定量分析;應(yīng)用免疫組織化學(xué)及原位雜交法分別檢測PNS患兒腎組織中P-gp170蛋白及mRNA的表達(dá)，比較不同腎臟病理類型及病理積分患兒P-gp170的表達(dá);比較未用GC與應(yīng)用GC后PNS患兒腎組織P-gp170的表達(dá)。結(jié)果? ①正常腎臟即有一定量的P-gp170表達(dá);未用GC組即高于正常對照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;②病理積分較高者P-gp170表達(dá)陽性量高于病理積分低者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;不同病理類型P-gp170的表達(dá)有差異，局灶節(jié)段硬化（FSGS）、膜性腎?。∕N）和硬化性腎?。⊿GN）表達(dá)較高，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），微小病變（MCD）和系膜增生型（MsPGN）者表達(dá)較低，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;而前三者與后兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;③未用GC者較應(yīng)用GC后的PNS患兒腎組織P-gp170表達(dá)量低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? P-gp170在PNS患兒腎組織的表達(dá)可能與腎病病損有關(guān)，可結(jié)合病理類型和病理損傷程度同時(shí)檢測腎組織P-gp170預(yù)測不同患兒GC反應(yīng)性; P-gp170的表達(dá)增高可能與PNS活動和復(fù)發(fā)有關(guān)，可作為臨床預(yù)測預(yù)后的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：腎病綜合征;P-糖蛋白170;糖皮質(zhì)激素;耐藥;兒童

中圖分類號：R726.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.21.017

文章編號：1006-1959（2018）21-0061-05

Relationship between the Expression of p-gp170 Protein and mRNA in Renal Tissue of Children with Primary Nephrotic Syndrome and Clinical Pathology and Prognosis

LIU Guang-tao1，GUAN Feng-jun2，DONG Chen2

（1.Department of Pediatrics，the First People's Hospital，Changzhou 213000，Jiangsu，China;

2.Department of Pediatrics，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University，Xuzhou 221000，Jiangsu，China）

Abstract：Objective? To observe the expression of P-glycoprotein 170 in renal tissues of children with primary nephrotic syndrome， and to analyze the relationship between P-gp170 expression and clinical and pathological changes in renal tissues， and to investigate the expression of P-gp170 in GC-resistant children with PNS effect. Methods? Renal tissue samples from 96 children with PNS in different stages of disease were obtained by renal biopsy. The routine pathological diagnosis and quantitative analysis of renal pathology were performed.Immunohistochemistry and in situ hybridization were used to detect the expression of P-gp170 protein and mRNA in renal tissues of children with PNS， and the expression of P-gp170 in different renal pathological types and pathological scores were compared.The expression of P-gp170 in renal tissue of children with PNS after GC and GC application was compared.Results? ①There was a certain amount of P-gp170 expression in normal kidney，The GC group was significantly higher than the normal control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.②The positive expression of P-gp170 was higher than the pathological score，the difference was statistically significant （P<0.05）.The expression of P-gp170 was different in different pathological types. The expressions of focal segmental sclerosis （FSGS）， membranous nephropathy （MN） and sclerosing nephropathy （SGN） were higher. There was no significant difference between the two groups （P>0.05）. The expressions of microscopic lesions （MCD） and mesangial proliferative （MsPGN） were lower，the difference was not statistically significant （P>0.05）. The difference between the first three and the latter two was statistically significant （P<0.05）.③The expression of P-gp170 in renal tissue of children with NS after GC was lower than that of patients with GC， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? The expression of P-gp170 in renal tissue of PNS children may be related to nephropathy. Renal P-gp170 can be combined with pathological type and degree of pathological injury to predict GC reactivity in different children. The increased expression of P-gp170 may be related to the activity and recurrence of PNS， and can be used as a predictor of prognosis.

Key words：Neph rotic syndrome;P-glycoprotein 170;Glucocorticoid;Drug resistance;Children

原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是兒童時(shí)期較為常見的一種腎臟疾病，其主要治療藥物為糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC），研究表明[1]，同一病理改變的不同腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）患兒對GC反應(yīng)不同，不同病理類型對GC反應(yīng)存在顯著差異。而初始GC不足的患兒往往后來表現(xiàn)對GC不敏感，另有一部分最初對GC敏感，GC應(yīng)用一段時(shí)間后，出現(xiàn)對GC抵抗，或反復(fù)復(fù)發(fā)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[2]，GC敏感和GC耐藥PNS患兒腎組織存在P-糖蛋白170（P-glycoprotein170，P-gp170）表達(dá)的差異，GC 耐藥PNS患兒存在腎臟原位P-gp170的過度表達(dá)，推測P-gp170腎組織的表達(dá)異常可能是一個(gè)新的病理生理環(huán)節(jié)，參與了PNS的GC耐藥的發(fā)生。本研究分析P-gp170的表達(dá)與臨床GC反應(yīng)性指標(biāo)間的關(guān)系，旨在揭示PNS耐藥發(fā)生機(jī)制。

1資料與方法

1.1一般資料? 選擇2013年1月～2015年6月在常州市第一人民醫(yī)院兒科住院的符合原發(fā)性NS診斷標(biāo)準(zhǔn)的患兒96例，男57例，女39例，年齡2～12歲，平均年齡（7.48±0.63）歲，無陽性家族史。本研究經(jīng)我院經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。依據(jù)腎穿刺的時(shí)間將病例分為：未用GC治療者;GC應(yīng)用半年內(nèi)未復(fù)發(fā)者;反復(fù)復(fù)發(fā)，病程一年內(nèi)者;隨訪時(shí)間1年。對照組腎組織為在我院泌尿外科住院的10例因外傷腎切除的組織，對照組患兒男6例，女4例，年齡6歲5個(gè)月～12歲9個(gè)月，平均年齡（9.62±0.78）歲，這些患兒既往無腎臟疾病病史;血壓、血常規(guī)、尿常規(guī)及肝腎功能均正常;取腎組織前4周無感染、過敏性疾病、服藥史;肉眼和光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織無病理學(xué)異常改變。PNS患兒與對照組的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2觀察指標(biāo)

1.2.1病理指標(biāo)? 包括腎臟病理類型及腎臟病理積分及腎組織P-gp170蛋白及mRNA的表達(dá)。其中腎小球病理評分標(biāo)準(zhǔn)為：①系膜細(xì)胞增殖：按無、輕、中、重度增殖分別記0，1，2和3分。②基質(zhì)增寬：正常，記0分;輕度變化呈節(jié)段性增寬，毛細(xì)血管袢無明顯影響，記1分;中度變化呈彌漫性增寬，<50%毛細(xì)血管袢狹窄閉鎖，記2分;重度變化呈彌漫性增寬，>50%毛細(xì)血管袢狹窄閉鎖，記3分。③硬化改變：正常，記0分;局灶節(jié)段分布，硬化腎小球<30%，記1分;硬化腎小球>30%～60%，記2分 ;硬化腎小球>60%，記3分。④新月體或纖維形成：正常（無形成），記0分;呈局灶節(jié)段分布<25%，記1分;彌漫性節(jié)段分布25%～50%，記2分;彌漫性灶性分布>50%，記3分。

1.2.2臨床觀察指標(biāo)? 應(yīng)用GC者均為初始口服強(qiáng)的松2 mg/（kg·d），按正規(guī)療程減量。

1.3主要試劑? P-gp170鼠抗人單克隆抗體（Sigma公司，批號200601）;免疫組化試劑盒（Sigma公司，批號2005BA0131）;多藥耐藥基因原位雜交檢測試劑盒（MDR ISH Detection Kit）， 產(chǎn)品目錄號：MK1153，針對人MDR1靶基因的mRNA序列為：①5'-ATGCT GGTGT TCGGA TACAT GACAG ATAGT TTTAC-3';②5'-CTGCC TATGA? AATCT TCAAG? ATAAT TGATA ATGAG-3';③5'-TGCTG CTTGT TTCCG GTTCG GTGCC TACTT GGTGG-3'。

1.4方法和步驟

1.4.1腎組織常規(guī)染色? 腎組織取出后，進(jìn)行免疫組化檢測和常規(guī)染色，電鏡檢查由電鏡室報(bào)告檢驗(yàn)結(jié)果。2周內(nèi)進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，按照說明書進(jìn)行。

1.4.2腎組織免疫組化測定? 腎組織石蠟切片，脫蠟，脫水，滅活，蒸餾水洗滌，修復(fù)抗原，蛋白酶K消化，PBS洗滌，封閉，加一抗（1∶100），4 ℃過夜，同時(shí)做陰性對照。PBS洗滌，加二抗，37 ℃放置30 min。PBS洗滌，滴加鏈親和素-過氧化酶溶液，37 ℃孵育，PBS洗滌，DAB顯色，蒸餾水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.4.3腎組織原位雜交測定p-gp170mRNA表達(dá)? 室溫處理玻片，蒸餾水洗滌，胃蛋白酶，37 ℃消化。原位雜交用 PBS洗滌，后固定，預(yù)雜交，雜交：按每張切片20 μl雜交液，雜交后過夜，洗滌，滴加封閉液，滴加生物素化鼠抗地高辛，原位雜交用PBS洗滌，滴加SABC，PBS洗滌。滴加生物素化過氧化物酶，PBS洗滌，DAB顯色，脫水，二甲苯透明，封片。

1.4.4腎病理定量分析方法? 按中南大學(xué)湘雅二院小兒腎臟病研究室吳小川等[3]所制定的小兒紫癜性腎炎病理定量分析方法進(jìn)行，分別對腎小球與腎小管-間質(zhì)的病理改變進(jìn)行半定量評分。

1.4.5免疫組化及原位雜交結(jié)果觀測? 在光學(xué)顯微鏡下以及應(yīng)用IBAS2000圖像分析系統(tǒng)（德國OPTON公司）對免疫反應(yīng)物進(jìn)行觀察，測定每個(gè)觀察視野（×100）A 區(qū)域（腎小球、腎小管和間質(zhì)）的輝度（GA）、陽性產(chǎn)物α相的輝度（Gα）及面積密度（AAα），按公式計(jì)算觀察視野中的P-gp170陽性單位（PU）值。PU=100×∣Gα-GA∣/[（1-AAα）·Gmax]，其中Gmax為儀器的最大輝度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，所有資料均采用（x±s）表示;所有數(shù)據(jù)分析之前都進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。多組資料間和同組多個(gè)時(shí)點(diǎn)資料間比較，方差齊者，采用One-Way ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊者，采用Kruskal-Wallis分析，組間兩兩比較采用Mann-Whitney法，各參數(shù)間的相關(guān)性分析采用Mann-Whitney線性相關(guān)及Spearman等級相關(guān)分析;以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01 為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2結(jié)果

2.1各組腎組織中P-gp170的表達(dá)特點(diǎn)? 對照組腎小球固有細(xì)胞無陽性信號，腎小管和腎間質(zhì)均有P-gp170mRNA和蛋白的表達(dá);PNS各組患兒P-gp170的表達(dá)分布與正常對照基本相同，但各部位陽性信號明顯高于對照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;初發(fā)未用GC者、初發(fā)應(yīng)用GC治療半年未復(fù)發(fā)者、反復(fù)復(fù)發(fā)<12個(gè)月者各組比較，未用GC與其它各組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;應(yīng)用GC 兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1～表4。

2.2不同腎臟病理積分P-gp170表達(dá)比較? 腎臟病理積分較高者P-gp170表達(dá)陽性率較病理積分低者增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），腎小管間質(zhì)損害重者P-gp170的表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1～表3。

2.3不同腎臟病理類型P-gp170表達(dá)比較? 反復(fù)復(fù)發(fā)者不同病理類型P-gp170的表達(dá)有差異，局灶節(jié)段硬化和膜性腎病、硬化性腎炎表達(dá)較高，微小病變腎病和系膜增生性表達(dá)最低，前三者與后兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

3討論

PNS的GC耐藥是涉及多因素、多步驟的病理過程，GC的反應(yīng)性影響著PNS的轉(zhuǎn)歸。臨床研究發(fā)現(xiàn)[4]，腎臟病理組織學(xué)不同，對GC的反應(yīng)往往不同;此外，治療方式也與GC耐藥有關(guān)[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)MDR1基因和P-gp170與多種臨床和病理指標(biāo)密切相關(guān)[6]。GC的應(yīng)用可影響P-gp170的表達(dá)，進(jìn)而影響GC的療效[7]。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，P-gp170在正常人腎臟組織中即有一定量的表達(dá)，而PNS患兒腎組織P-gp170的表達(dá)增高，提示該因子表達(dá)異?？赡芘c腎臟病變有關(guān)。以往有學(xué)者在白血病的研究[8]中得出了類似的結(jié)論：某些P-gp170高表達(dá)患者在化療前已存在原發(fā)耐藥，對化療不敏感，療效較差，故P-gp170可作為白血病預(yù)測預(yù)后的指標(biāo)。我們認(rèn)為，這部分患兒GC治療前即有P-gp170表達(dá)增高，說明他們本身即可能存在原發(fā)GC耐藥。P-gp170是人類MDR1基因產(chǎn)物，MDR1是與多藥耐藥相關(guān)的最重要基因，亦證實(shí)NS腎組織細(xì)胞具有內(nèi)源性 MDR1 特性，存在一定的天然耐藥性。因此，檢測病人的MDR1可能為臨床提供一個(gè)有意義的指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同病理類型P-gp170表達(dá)存在差異，因而我們推測，PNS患兒腎活檢同時(shí)若行P-gp170的檢測，P-gp170表達(dá)量的高低可反映GC的療效，低表達(dá)的病理類型對GC治療敏感;反之，高表達(dá)者對GC治療抵抗。這與病理類型表現(xiàn)為微小病變型和系膜增生型腎小球腎炎的患兒對GC的療效優(yōu)于膜性腎病、硬化性腎病的臨床結(jié)果相似[9]。但本實(shí)驗(yàn)選擇的病例數(shù)較少，尤其是硬化型者較少，故本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果尚有待于進(jìn)一步證實(shí)。而病理積分與P-gp170表達(dá)的關(guān)系表明病理損傷越重，P-gp170表達(dá)水平越高，GC耐藥的幾率增加。故我們推測P-gp170表達(dá)水平與病理損傷的程度有某種關(guān)聯(lián)，可能由于病理損傷致P-gp170表達(dá)進(jìn)一步增高，也可能由于炎癥介質(zhì)表達(dá)增多而促進(jìn)了P-gp170表達(dá)增多，從而介導(dǎo)耐藥。

研究表明[10]，耐藥的產(chǎn)生可以出現(xiàn)在治療前，稱為原發(fā)性耐藥或內(nèi)在性耐藥;也可以在治療過程中逐漸出現(xiàn)或復(fù)發(fā)后出現(xiàn)，稱為獲得性耐藥或繼發(fā)性耐藥，本研究結(jié)果與上述多種疾病的耐藥背景相似。因此我們推測，MDR1基因及表達(dá)產(chǎn)物與GC互相作用，相互拮抗在PNS繼發(fā)耐藥中發(fā)揮了重要的作用。P-gp170的高表達(dá)可導(dǎo)致病人GC耐藥，GC用量引發(fā)了P-gp170的表達(dá)改變，從而導(dǎo)致GC耐藥;因而，監(jiān)測P-gp170的表達(dá)變化有助于對患者GC療效的判斷。

綜上所述，P-gp170在PNS患兒腎組織的表達(dá)與腎病病損有關(guān)，可結(jié)合病理類型和病理損傷程度同時(shí)檢測腎組織P-gp170來預(yù)測不同患兒GC反應(yīng)性; P-gp170的表達(dá)增高可能與NS活動和復(fù)發(fā)有關(guān)，可作為臨床預(yù)測預(yù)后的指標(biāo)。

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