運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠紋狀體DA含量及AMPA受體亞基表達(dá)可塑性的影響

陳東方++畢妍++孫雪

摘 要：觀察中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)紋狀體內(nèi)多巴胺（dopamine，DA）含量及ɑ-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）受體表達(dá)的影響，探求運(yùn)動(dòng)促進(jìn)腦可塑性的機(jī)制。方法：清潔級(jí)SD大鼠62只分為4組：安靜對(duì)照組（Sham）、運(yùn)動(dòng)7 d組（Ex7）、運(yùn)動(dòng)14 d組（Ex14）和運(yùn)動(dòng)28 d組（Ex28）。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)方案為11 m/min，30 min/day。采用Panlab系統(tǒng)觀察運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠自主活動(dòng)能力的影響；采用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）觀察紋狀體DA含量，采用免疫組織化學(xué)和Western-blotting觀察運(yùn)動(dòng)對(duì)紋狀體AMPA受體的GluR1和GluR2/3亞基表達(dá)水平的影響。結(jié)果：采用Smart 3.0軟件分析大鼠自主活動(dòng)能力結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期（第14和28 d）運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以顯著增加大鼠自主活動(dòng)能力（P<0.01）；HPLC結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ex28組較Sham組DA含量顯著升高（P<0.01），而Ex14和Ex7組較Sham組無顯著改善（P>0.05）；免疫組織化學(xué)檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期（第14和28 d）運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以顯著增加GluR1和GluR2/3亞基的表達(dá)（14 d：P<0.05，28 d：P<0.01），短期運(yùn)動(dòng)（第7 d）較Sham組無顯著改善（P>0.05）。結(jié)論：跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以顯著提高大鼠的自主活動(dòng)能力及紋狀體DA含量和GluR1和GluR2/3亞基的表達(dá)水平，對(duì)紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)含量和受體表達(dá)產(chǎn)生可塑性影響。推測：DA含量提升和AMPA受體亞基表達(dá)的改變是運(yùn)動(dòng)提升大鼠運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的重要基礎(chǔ)之一，可能是運(yùn)動(dòng)改善學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知和行為的可塑性機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：運(yùn)動(dòng)；紋狀體；多巴胺；AMPA受體；大鼠；可塑性

中圖分類號(hào)：G 804.2 文章編號(hào)：1009-783X（2017）06-0561-04 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Objective： To study the plasticity mechanism of moderate exercise on the brain structure， we investigated the expression of the AMPA receptor subunits （GluR1 and GluR2/3） and dopamine contents in striatum. Methods： Sixty-two adult male Sprague Dawley rats were randomly divided into four groups according to duration of treadmill exercise， namely 7 days （Ex7）， 14 days （Ex14）， 28 days （Ex28） and Sham groups. All the rats in the exercise group were forced to run on a motorized treadmill （11 m/min for 30 min each day）. As behavioral evaluations， autonomic movement were recorded by the Panlab system. After exercise， the brains were subjected to immunohisochemistry and immunoblotting to analyze changes of GluR1 and GluR2/3. Animals in high-performance liquid chromatography （HPLC） experiment group were used to test dopamine contents in striatum. Results： After exercise， the automatic movement of rats in the exercise group significantly increased in Ex14 and Ex28 compared with the Sham group（P<0.01）. HPLCresults indicated that dopamine in Ex28 group were higher than in Sham group（P< 0.01）， but there are no significant changes between Ex7 and Ex14 compared with Sham rats（P > 0.05）. There was an increased expression of GluR2/3 and a decreased GluR1 expression in Ex14 and Ex28 groups compared with the Sham group（Ex14： P < 0.05； Ex28： P < 0.01） while Ex7 groups did not（P>0.05）. Conclusion： Our research show that the exercise protocol used is able to promote plastic GluR expression and dopamine contents during exercise， suggesting a specific involvement of these receptors in exercise-induced plasticity processes in brain.endprint

Keywords： exercise； striatum； dopamine； AMPA receptor； rat； plasticity

過去的幾十年中，運(yùn)動(dòng)對(duì)大腦可塑性影響的研究廣泛開展。眾多基礎(chǔ)研究表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以對(duì)正?；蚴軗p大腦神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生可塑性影響，且運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)的腦可塑性與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間有關(guān)[1-2]。紋狀體在運(yùn)動(dòng)技能學(xué)習(xí)及動(dòng)作執(zhí)行過程中起重要作用，多巴胺（dopamine，DA）和谷氨酸（glutamate，Glu）是調(diào)控紋狀體功能狀態(tài)的2類主要神經(jīng)遞質(zhì)。研究表明，DA系統(tǒng)是成癮和獎(jiǎng)賞行為的重要神經(jīng)基礎(chǔ)，運(yùn)動(dòng)成就和欣快感也是由DA系統(tǒng)介導(dǎo)，適宜的運(yùn)動(dòng)形式和強(qiáng)度對(duì)DA系統(tǒng)的可塑性影響是改善腦健康的重要機(jī)制。Glu通過與相關(guān)受體結(jié)合激活Ca2+內(nèi)流引起細(xì)胞去極化，從而使胞內(nèi)的酶活化產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，該過程是腦神經(jīng)可塑性產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一。Glu的受體并不是突觸的靜態(tài)組件，AMPA（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate receptor，AMPAR）受體通過與后膜的結(jié)合與分離完成信息傳遞，其亞基（GLuR1和GluR2/3）在突觸可塑性和動(dòng)作技能學(xué)習(xí)方面具有直接的作用[3]。AMPA受體參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的快速興奮突觸傳遞，對(duì)正常的腦功能維持起著重要作用[4-5]，其亞基表達(dá)的改變是突觸可塑性發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，這可能是運(yùn)動(dòng)影響學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知和行為的可塑性機(jī)制之一[6]。紋狀體DA減少或AMPA受體亞型表達(dá)的病理改變是許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，二者的可塑性改變可能是運(yùn)動(dòng)促進(jìn)腦健康的機(jī)制之一。作為運(yùn)動(dòng)干預(yù)介導(dǎo)可塑性的重要作用靶點(diǎn)，DA含量與AMPA受體表達(dá)的改變與運(yùn)動(dòng)促進(jìn)腦健康的神經(jīng)機(jī)制密切相關(guān)。為此，本研究采用HPLC和免疫組織化學(xué)及免疫印跡的方法，分別觀察了不同運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間的中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)大鼠紋狀體DA含量及AMPA受體亞基（GluR1和GluR2/3）表達(dá)的影響，探求運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練促進(jìn)大腦可塑性的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

實(shí)驗(yàn)選用健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量220～240 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2011-2012。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分假手術(shù)安靜組（Sham，n=14）、7 d運(yùn)動(dòng)組（Ex7，n=16）、14 d運(yùn)動(dòng)組（Ex14，n=16）和30 d運(yùn)動(dòng)組（Ex28，n=16）。

1.2 運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

采用Tajiri [7]等提出的中等強(qiáng)度勻速跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案，大鼠執(zhí)行該強(qiáng)度時(shí)心率為65%～75% 的最大心率。運(yùn)動(dòng)方案為：11 m/min，30 min/day[7]。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示。

1.3 行為學(xué)測試

采用Panlab系統(tǒng)進(jìn)行自主能力測試實(shí)驗(yàn)，用于評(píng)估大鼠的運(yùn)動(dòng)能力。每只大鼠放于直徑50 cm的實(shí)驗(yàn)箱的中央，讓大鼠自由活動(dòng)5 min，攝像頭同步記錄其在箱體的活動(dòng)。采用Smart 3.0 軟件分析5 min內(nèi)大鼠自主活動(dòng)時(shí)間、靜止時(shí)間和精細(xì)動(dòng)作時(shí)間所占比例。參照Alexxai [8]行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，自主活動(dòng)時(shí)間是指動(dòng)物平均中心速度大于2 cm/s且持續(xù)時(shí)間超過0.5 s；靜止時(shí)間是指動(dòng)物靜止的時(shí)間不小于1 s；精細(xì)動(dòng)作時(shí)間包括理毛、站立等特殊精細(xì)行為。

1.4 免疫組化實(shí)驗(yàn)

各組大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第2 天，用10%的水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，灌流取腦，腦組織置于4%多聚甲醛中固定12 h。固定好后分離紋狀體，梯度酒精脫水、二甲苯中透明2次，石蠟包埋備用。蠟塊連續(xù)冠狀切片，每6張選1張，片厚5 μm。順序貼片、烤片、脫蠟及水化。PBS沖洗、抗原修復(fù)后滴加3%雙氧水在載玻片上，封閉20 min，加入GluR1和GluR2/3的一抗（1∶100，Chemicon，Temecula，CA，USA）4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫20 min，PBS沖洗，加入二抗（1∶200，Proteintech Group，USA），室溫孵育1 h，PBS沖洗3次。DAB顯色劑染色，PBS沖洗后采用蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用奧林巴斯顯微鏡對(duì)紋狀體背外側(cè)區(qū)域拍照。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)免疫陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 Western blot

各組大鼠在試驗(yàn)結(jié)束后的第2 天，斷頭取腦，于冰上快速分離紋狀體，置于-80 ℃的冰箱。檢測時(shí)取出組織置于預(yù)冷的研缽體中碾碎，轉(zhuǎn)入EP管，加入組織裂解液，勻漿后離心，取上清液樣品，測定總蛋白含量，另取上清液 樣品置于-80 ℃冰箱保存。樣品經(jīng)10%SDS-PAGE膠分離后，經(jīng)4 ℃、18 V恒壓1 h；在一抗溶液中4 ℃孵育過夜，漂洗后在HRP標(biāo)記的二抗溶液中室溫孵育60 min，β-actin作內(nèi)參。ECL檢測膠帶，X光膠片曝光、沖洗。將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶積分光密度值（IOD）。

1.6 紋狀體DA含量高效液相色譜-電化學(xué)聯(lián)測法檢測

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h，用10%水合氯醛（4.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，斷頭取腦，準(zhǔn)確稱量紋狀體質(zhì)量，以1∶9（體積分?jǐn)?shù)）加入生理鹽水，玻璃勻漿器冰浴勻漿，離心取上清液，以1∶2（體積比）加入0.4 mol/L高氯酸去蛋白，低溫下取上清液，加入碳酸鉀溶液稀釋后低溫離心，取上清液，加入衍生劑，混勻待測。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取DA 0.5 mg→用dd H2O稀釋至0.5 mL→制成1 μg/μL的貯備液→取10 μL，加流動(dòng)相990 μL稀釋→10ng/μL的貯備液→取40μL，加流動(dòng)相稀釋至500 μL→用流動(dòng)相倍比稀釋得6個(gè)濃度梯度：8、4、2、1、0.5 ng/20 μL。色譜條件：色譜柱為ODS-SP反相色譜柱（4.6×150 mm，5 μm），流動(dòng)相：V（甲醇）∶V（雙蒸水）=1∶9，其中ddH2O中每升含NaH2PO4 0.1 mol/L，EDTA·2Na（2H2O） 0.027 mmol/L，辛烷磺酸鈉0.74 mmol/L，Kcl 2 mol/L；流速為0.25 mL/min，柱溫為35 ℃，調(diào)節(jié)PH為3。上樣分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量計(jì)算：1）設(shè)定ECD電壓為0.65 V， 樣品流量1.0 mL/min，每一樣品檢測時(shí)間為35 min；2）將標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)樣，檢測并且記錄其保留時(shí)間作為定性指標(biāo)；3）將5種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合并稀釋，然后依次進(jìn)樣，檢測并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線回歸方程，得出相應(yīng)含量。endprint

1.7 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用sigmaplot 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用雙因素方差分析（Two-Way ANOVA），組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 自主活動(dòng)能力測試結(jié)果

自主活動(dòng)能力測試結(jié)果顯示：與Sham組相比，Ex7和Ex14組的大鼠靜止?fàn)顟B(tài)和精細(xì)動(dòng)作所占時(shí)間比例沒有顯著性改變（P>0.05）；但Ex14組大鼠的自主活動(dòng)時(shí)間所占時(shí)間比例顯著升高（P<0.05），而Ex28組，大鼠自主活動(dòng)和精細(xì)動(dòng)作的時(shí)間所占比例顯著升高（P<0.01，P<0.05），靜止?fàn)顟B(tài)的時(shí)間顯著降低（P<0.01），如圖2所示。

2.2 免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示如圖3所示：與Sham組相比，Ex14和Ex28組的紋狀體GluR1表達(dá)均上調(diào)，差異具有顯著性（Ex14組P<0.05，Ex28組P<0.01）；而Ex7組的表達(dá)沒有顯著性差異（P>0.05）。與Sham組相比，Ex14和Ex28的GluR2/3的表達(dá)顯著上調(diào)，差異具有顯著性（Ex14組P<0.05，Ex28組P<0.01）；而Ex7組的表達(dá)沒有顯著性差異（P> 0.05）。

2.3 Western-blotting 結(jié)果

Western-blotting結(jié)果顯示，Ex7組的紋狀體GluR1與GluR2/3的表達(dá)與Sham組相比均無顯著性差異（P>0.05）；而與Sham組相比，Ex14與Ex28組的紋狀體GluR1和GluR2/3的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，且差異具有顯著性（Ex14組P<0.05，Ex28組P<0.01）。Western-blotting的結(jié)果顯示，各組大鼠GluR1和GluR2/3的免疫組織化結(jié)果趨勢一致。

2.4 大鼠紋狀體內(nèi)DA含量變化

各組大鼠紋狀體內(nèi)DA水平如圖5所示，與Sham組相比，Ex7和Ex14組紋狀體內(nèi)的DA水平均無顯著性改變（P>0.05），而Ex28組的DA水平顯著升高（P<0.01）。

3 討論

紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)最大的信息輸入核團(tuán)，它接受來自黑質(zhì)DA能及皮層和丘腦的Glu能的投射，DA是兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的一種，它參與認(rèn)知、情感、內(nèi)分泌等多種功能的調(diào)控[9]；皮層-紋狀體Glu的神經(jīng)傳導(dǎo)被證實(shí)是習(xí)慣化運(yùn)動(dòng)和目標(biāo)運(yùn)動(dòng)技能形成的神經(jīng)環(huán)路[11-12]。紋狀體是腦內(nèi)DA含量最高的結(jié)構(gòu)，其DA含量占全腦的70%～80%，紋狀體內(nèi)DA水平與運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)能力密切相關(guān)，有研究證實(shí)腦內(nèi)DA水平增高可增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)控制的神經(jīng)元活性，促進(jìn)耐力性運(yùn)動(dòng)成績的提高[13-14]。DA系統(tǒng)參與技能學(xué)習(xí)與動(dòng)作執(zhí)行，DA對(duì)行為功能的影響存在不同胞內(nèi)信號(hào)控制路徑，DA與D1型受體結(jié)合可異化運(yùn)動(dòng)，與D2型受體結(jié)合可拮抗運(yùn)動(dòng)并減少多余動(dòng)作。AMPA受體亞基表達(dá)改變調(diào)節(jié)參與運(yùn)動(dòng)技能學(xué)習(xí)相關(guān)的突觸可塑性，皮層-紋狀體突觸后AMPA受體亞基表達(dá)改變對(duì)突觸快速興奮性傳導(dǎo)效率（即突觸傳遞的可塑性）起決定性作用[15-17]。AMPA受體亞基在Glu的突觸傳遞過程中起著重要作用，其中GluR2/3在正常情況下控制Ca2+內(nèi)流量，在病理狀態(tài)下如帕金森病，GluR2/3的表達(dá)量下降，導(dǎo)致流入紋狀體神經(jīng)元胞內(nèi)的Ca2+增多，會(huì)引起級(jí)聯(lián)的興奮性毒作用，GluR2/3介導(dǎo)的興奮性毒作用被認(rèn)為是帕金森病發(fā)病機(jī)制的一種[11-12]。

許多研究表明，運(yùn)動(dòng)可以通過促進(jìn)大腦代謝水平，刺激神經(jīng)的發(fā)生，從而改善正?；虿±恚ㄈ缒X卒中或神經(jīng)退行性病變）狀態(tài)下的行為功能[10，15-16]。Van等的研究發(fā)現(xiàn)，自主跑輪運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)海馬神經(jīng)元的發(fā)生，增強(qiáng)突觸可塑性，是運(yùn)動(dòng)記憶增強(qiáng)的神經(jīng)基礎(chǔ)[17]；Molteni等[1]的研究發(fā)現(xiàn)，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)動(dòng)物技能學(xué)習(xí)的同時(shí)伴隨著皮層-紋狀體Glu傳導(dǎo)的改變；Tajiri等[7]采用中等強(qiáng)度跑臺(tái)早期干預(yù)帕金森病模型大鼠發(fā)現(xiàn)可以減少黑質(zhì)-紋狀體DA的損耗，加強(qiáng)對(duì)大腦的神經(jīng)保護(hù)作用。VanLeeuwen等[18]采用高強(qiáng)度間歇跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)迫帕金森病模型小鼠訓(xùn)練，4周后發(fā)現(xiàn)AMPA受體GluR2/3的表達(dá)相較于病理狀態(tài)顯著下調(diào)，AMPA受體可能是運(yùn)動(dòng)改善帕金森病模型行為功能的腦內(nèi)作用靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)長期有氧運(yùn)動(dòng)可增加中腦及紋狀體DA含量，與運(yùn)動(dòng)技能學(xué)習(xí)的提升密切相關(guān)[19]。紋狀體內(nèi)DA和Glu遞質(zhì)平衡對(duì)正常運(yùn)動(dòng)執(zhí)行至關(guān)重要，紋狀體主要參與運(yùn)動(dòng)的順序?qū)W習(xí)和運(yùn)動(dòng)后期動(dòng)作的自動(dòng)發(fā)起[20]。本研究發(fā)現(xiàn)：Ex28組大鼠較對(duì)照組紋狀體DA含量增高的同時(shí)伴隨自主活動(dòng)能力的增強(qiáng)，這與前人研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)促進(jìn)DA分泌、提高自主活動(dòng)能力相一致；同時(shí)Ex7組較Control組沒有顯著差異，表明運(yùn)動(dòng)對(duì)DA含量的影響存在時(shí)間依賴效應(yīng)。Ex14與Ex28組較Control組GluR1和GluR2/3亞基的表達(dá)量均有增加，提示亞基的表達(dá)與后期運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)的突觸可塑性有關(guān)這與Smith等的研究結(jié)果一致[21]。本研究進(jìn)一步證實(shí)，紋狀體DA和AMPA受體亞基是運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)腦可塑性的重要作用靶點(diǎn)，DA含量提升和AMPA受體亞基表達(dá)的改變是運(yùn)動(dòng)提升大鼠運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的重要基礎(chǔ)之一，可能是運(yùn)動(dòng)改善學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知和行為的可塑性機(jī)制之一。

4 結(jié)束語

跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以顯著提高大鼠的自主活動(dòng)能力及紋狀體DA含量和GluR1與GluR2/3亞基的表達(dá)水平，對(duì)紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)含量和受體表達(dá)產(chǎn)生可塑性影響。推測：DA含量提升和AMPA受體亞基表達(dá)的改變不僅是運(yùn)動(dòng)提升大鼠運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的重要基礎(chǔ)之一，而且可能是運(yùn)動(dòng)改善學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知和行為的可塑性機(jī)制的重要因素。

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