1株黑曲霉固態(tài)發(fā)酵豆渣生產(chǎn)纖維素酶及淀粉酶工藝的優(yōu)化

高大響+黃小忠

摘要： 以豆渣為主要原料，利用黑曲霉為產(chǎn)酶菌株，在29 ℃下，通過固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶。單因子和正交試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)纖維素酶的最佳條件為：15 g干豆渣、含水量55%、黑曲霉接種量1.7 mL、培養(yǎng)時間84 h；產(chǎn)淀粉酶的最佳條件為：15 g干豆渣、含水量60%、黑曲霉接種量1.5 mL、培養(yǎng)時間60 h。在此條件下，纖維素酶活力達(dá) 475 U/g，淀粉酶活力為198 U/g。說明利用黑曲霉對豆渣進(jìn)行固體發(fā)酵產(chǎn)酶是可行的，具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞： 豆渣；黑曲霉；固態(tài)發(fā)酵；纖維素酶；淀粉酶；工藝優(yōu)化

中圖分類號： S188+.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0218-03

豆渣是大豆制品加工中的副產(chǎn)物，主要成分是纖維素和蛋白質(zhì)，還含有維生素以及鈣、鎂、鉀、鐵等礦物質(zhì)，其口感粗糙，有豆腥味。國外多采用酶解法處理豆渣，直接用微生物發(fā)酵法處理豆渣的研究較少。國內(nèi)多利用微生物發(fā)酵豆渣來生產(chǎn)糖化菌粉、核黃素[1]和蛋白酶[2]，利用微生物發(fā)酵豆渣來生產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶的研究尚未見報道。

纖維素酶是開發(fā)纖維素轉(zhuǎn)變成能源和其他資源的一種高效、安全的生物方法，其生產(chǎn)方法有液體發(fā)酵法和固體發(fā)酵法[3]。纖維素酶生產(chǎn)菌多為木霉、曲霉及少數(shù)細(xì)菌，木霉是目前公認(rèn)較好的纖維素酶生產(chǎn)菌[4]。淀粉酶廣泛用于食品、紡織、造紙及醫(yī)藥等方面，主要產(chǎn)酶菌株為桿菌、黑曲霉和米曲霉[5]。本試驗(yàn)利用1株黑曲霉固態(tài)發(fā)酵豆渣生產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶，以實(shí)現(xiàn)資源的有效利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種為黑曲霉（Aspergillus niger），由筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選和保存。

豆渣，市售。

培養(yǎng)基：（1）斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，配方為300 g馬鈴薯、20 g 葡萄糖、20 g瓊脂、1 000 mL自來水，pH值自然；（2）固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，配方為適量干豆渣、2 g玉米秸稈粉、2 g麩皮、0.1 g（NH4）2SO4、0.1 mL 吐溫-80、適量水，pH值自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

將保存的黑曲霉菌種接至PDA培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 d得到成熟的孢子，加入已滅菌的去離子水，用接種環(huán)刮下孢子，倒入已滅菌的裝有玻璃珠（直徑3 mm，5～6粒）的三角瓶中，于 180 r/min 下振蕩5～10 min得孢子懸浮液，用去離子水將其D560 nm調(diào)至0.1（孢子懸浮液濃度約為1×106個/mL）備用[6]。所有操作均在無菌操作臺內(nèi)進(jìn)行。

1.2.2 固態(tài)培養(yǎng)物的制備

在250 mL錐形瓶中裝入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min，冷卻后接入孢子懸浮液，用無菌玻璃棒打碎并攪拌均勻，于29 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)期每天翻曲1～2次。

1.2.3 粗酶液制備

參照文獻(xiàn)[7]制備粗酶液，并略作改動。取5 g固態(tài)培養(yǎng)物于三角瓶中，加入50 mL蒸餾水，在 40 ℃ 水浴中浸提1 h。然后用脫脂棉過濾，濾液即為粗酶液，4 ℃保存，24 h內(nèi)使用。

1.2.4 纖維素酶活力測定

濾紙酶活力測定方法參照文獻(xiàn)[8]，并略有改動。取0.2 mL粗酶液，加入1.8 mL 0.1 mol/L、pH值為4.8的醋酸緩沖液，水浴至50 ℃，加入 50 mg（1 cm×6 cm）新華濾紙條，保溫60 min，以不加底物為對照。加入1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑（DNS試劑），沸水浴5 min，冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，測定其D520 nm。

纖維素酶活力定義：在50 ℃、pH值為4.8時，1 min水解濾紙釋放1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位，以 1 g 固體培養(yǎng)物所含的酶活力單位（U/g）表示。

1.2.5 淀粉酶活力測定

采用DNS法[9]測定淀粉酶的活力。淀粉酶活力定義：在60 ℃下，5 min內(nèi)降解1 mg/mL可溶性淀粉溶液生成1 μmol還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量為1個酶活單位，以1 g固體培養(yǎng)物所含的酶活力單位（U/g）表示。

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交試驗(yàn)表確定最優(yōu)產(chǎn)酶條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液含糖量為橫坐標(biāo)，D540 nm為縱坐標(biāo)，經(jīng)統(tǒng)計分析得線性回歸方程為y=0.012 8x-0.005 1，r2=0.995 1。曲線線性良好，可信度較高。

2.2 單因子對固態(tài)發(fā)酵豆渣產(chǎn)酶的影響

2.2.1 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

對固體發(fā)酵而言，培養(yǎng)溫度是首要因素。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入14 g粉碎的干豆渣，調(diào)節(jié)含水量為50%，接入1 mL孢子懸浮液，分別于27、28、29、30、31、32 ℃下培養(yǎng)60 h。由圖2可知，在29 ℃時淀粉酶活力最高，在30 ℃時纖維素酶活力最高，綜合考慮確定培養(yǎng)溫度為29 ℃。

2.2.2 豆渣干質(zhì)量對產(chǎn)酶的影響

分別稱取10、12、14、16、18、20 g粉碎的干豆渣，加入到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)含水量為50%，接入1 mL孢子懸浮液，29 ℃條件下培養(yǎng)60 h。由圖3可知，纖維素酶和淀粉酶的活力均隨豆渣干質(zhì)量的增加而增大。當(dāng)豆渣干質(zhì)量為14 g時，淀粉酶活力最大，為 133 U/g；豆渣干質(zhì)量為16 g時，纖維素酶活力最大，為 370 U/g，表明適當(dāng)增加豆渣干質(zhì)量有利于酶活力的提高?？赡芤?yàn)槎乖泻械鞍踪|(zhì)、多種微量元素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分供菌種利用產(chǎn)酶，其中含量占干物質(zhì)總量一半以上的纖維素對纖維素酶的產(chǎn)生具有誘導(dǎo)作用，使纖維素酶大量生成，含量較高的礦物質(zhì)（鈣、鎂、鉀等）和維生素有利于淀粉酶的積累[10]。之后豆渣干質(zhì)量增加，纖維素酶和淀粉酶的活力均隨之下降。酶活力下降的原因可能是豆渣干質(zhì)量過高，培養(yǎng)基中含水量不足，影響產(chǎn)酶效果。固體培養(yǎng)基中添加了少量的麩皮，麩皮中含有促進(jìn)微生物生長的營養(yǎng)因子，有利于初始階段菌株對碳源的有效利用，能夠提高酶活力[11]。endprint

2.2.3 培養(yǎng)基初始含水量對產(chǎn)酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)中，培養(yǎng)基的含水量對菌體生長和產(chǎn)酶極其重要，控制好培養(yǎng)基含水量是發(fā)酵過程的重要環(huán)節(jié)[12]。分別在含15 g干豆渣、接種量為1 mL的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入去離子水，使其含水量分別為40%、50%、55%、60%、65%、70%，29 ℃下培養(yǎng) 60 h。由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)基中含水量上升時， 2個酶活力均

隨之升高。當(dāng)含水量為55%時，纖維素酶和淀粉酶的活力均達(dá)到最大值，分別為426、155 U/g。培養(yǎng)基含水過多時，兩者酶活力隨著含水量的增加而減少。培養(yǎng)基含水量過低，無法滿足微生物生長對水分的需要，同時隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基的水分會減少，從而影響微生物的生長及產(chǎn)酶情況；而含水量太高，培養(yǎng)基松散性和透氣性變差，也影響了微生物的生長和產(chǎn)酶情況[13]。因此，選擇培養(yǎng)基含水量為55%時為最佳的培養(yǎng)條件。

2.2.4 接種量對產(chǎn)酶的影響

分別在含15 g干豆渣的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL孢子懸液，在含水量為55%、29 ℃條件下培養(yǎng)60 h。由圖5知，開始時接種量較小，纖維素酶和淀粉酶的活力隨接種量的增加而增加；當(dāng)接種量達(dá)到1.5 mL時，淀粉酶和纖維素酶的活力均最高；之后酶活力隨接種量的增加而下降。

接種量過小，菌體生長較弱，發(fā)酵周期延長，影響產(chǎn)酶；接種量過大，菌體生長較快，營養(yǎng)消耗過度，產(chǎn)酶期營養(yǎng)供應(yīng)不足。另外，菌體大量生長造成供氧不足，產(chǎn)熱多，曲內(nèi)溫度升高，從而進(jìn)一步影響菌絲的生長和酶的產(chǎn)生[14]。綜合考慮，選擇接種量為1.5 mL時為最佳的接種條件。

2.2.5 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基加入15 g干豆渣，含水量為55%，接種量為1.5 mL，在29 ℃條件下分別發(fā)酵36、48、60、72、84、96 h。由圖6可知，培養(yǎng)36 h時，纖維素酶和淀粉酶已經(jīng)產(chǎn)生，此時黑曲霉處于緩慢增長階段，固體培養(yǎng)基的內(nèi)部和表面有少量的白色菌絲形成；36～60 h是纖維素酶和淀粉酶快速形成時期，酶活力較高。淀粉酶活力在72 h時達(dá)到最大，為188 U/g。而纖維素酶活力在84 h時達(dá)到 462 U/g，以后繼續(xù)增加但增加量不大。由于60 h淀粉酶活力達(dá)到最大以后快速下降，而纖維素酶活力在84 h時繼續(xù)緩慢增加。因此，應(yīng)根據(jù)不同產(chǎn)酶目的，選取適宜的培養(yǎng)時間。

2.3 最優(yōu)產(chǎn)酶條件的確定

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用豆渣含量、黑曲霉接種量、培養(yǎng)基含水量、培養(yǎng)時間進(jìn)行正交試驗(yàn)。采用L9（34）正交試驗(yàn)確定最優(yōu)產(chǎn)酶條件，其因素及水平選取情況如表1所示。

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，由表2中的極差R可知，對纖維素酶和淀粉酶活力影響最大的因素是培養(yǎng)基含水量，4個因素對纖維素酶的影響力大小表現(xiàn)為C>A>B>D，對淀粉酶的影響力大小表現(xiàn)為C>D>B>A。生產(chǎn)纖維素酶的最佳條件是A2B3C2D3，而產(chǎn)淀粉酶的最佳條件是A2B2C3D1，即在 29 ℃ 條件下，生產(chǎn)纖維素酶的最佳條件是在固態(tài)培養(yǎng)基中加入15 g干豆渣、含水量為55%、接種量為1.7 mL、培養(yǎng)84 h，而生產(chǎn)淀粉酶的最佳條件是在固態(tài)培養(yǎng)基中加入15 g干豆渣、含水量為60%、接種量為1.5 mL、培養(yǎng)60 h。

經(jīng)驗(yàn)證，該優(yōu)化條件下所得纖維素酶和淀粉酶的活力分別為475、198 U/g。

3 結(jié)論

培養(yǎng)基含水量對產(chǎn)酶影響最為顯著，培養(yǎng)基中含水量過高時，培養(yǎng)基黏度增加，易結(jié)塊，透氣性差，氧氣供應(yīng)減少，影響產(chǎn)酶，2種酶的活力均迅速下降。

黑曲霉菌株產(chǎn)酶活力較高，因此，利用固態(tài)發(fā)酵豆渣產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶是可行的，這是一種很有應(yīng)用前景的制備方法。以豆渣作為微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的良好原料，不僅擴(kuò)大了產(chǎn)酶的來源和途徑，也使豆渣這一資源得到了充分利用，實(shí)現(xiàn)了

可持續(xù)發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] 戴小陽，羅澤民. 豆渣的有效利用[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996（1）：28-29.

[2]易嘉玲. 豆渣在食品工業(yè)中的利用[J]. 武漢食品工業(yè)學(xué)院學(xué)報，1994（1）：17-20.

[3]翁佩芳，吳祖芳. 復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵啤酒糟培養(yǎng)基優(yōu)化的研究[J]. 釀酒科技，2003（2）：67-69.

[4]Bhat M K. Cellulases and related enzymes in biotechnology[J]. Biotechnology Advances，2000，18（5）：355-383.

[5]喻鳳香，陳 煦，林親錄，等. 根霉淀粉酶的分離純化及部分性質(zhì)研究[J]. 釀酒，2006，33（4）：51-53.

[6]李愛華，岳思君，馬海濱. 真菌孢子三種計數(shù)方法相關(guān)性的探討[J]. 微生物學(xué)雜志，2006，26（2）：107-110.

[7]張 帥，陳 懿，董 基. 黑曲霉固態(tài)發(fā)酵橘皮生產(chǎn)纖維素酶及淀粉酶[J]. 食品科學(xué)，2012，33（11）：190-193.

[8]張 輝，桑 青. 響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉HQ-1產(chǎn)纖維素酶固體發(fā)酵條件[J]. 中國釀造，2011（7）：17-22.

[9]周傳云. 食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1999.

[10] 蘇小軍，熊興耀，譚興和，等. 黑曲霉AF-1固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生淀粉酶的條件優(yōu)化[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，35（2）：208-212.

[11]蘇香萍，龔大春，陳國華，等. 混合菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2010，21（12）：3330-3332.

[12]Gervais P，Molin P. The role of water in solid-state fermentation[J]. Biochemical Engineering Journal，2003，13（2/3）：85-101.

[13]李 蕾，張 力，喬 梁，等. 混菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件的優(yōu)化[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（10）：150-155.

[14]Theodorosh V，Sevastianos R，Ioanniss A. Glucoamylases production of Aspergillus niger in solid state fermentation using a continuous counter-current reactor[J]. International Journal of Food Science & Technology，2010，43（7）：1159-1168.endprint