中藥成分復(fù)方及其組分對(duì)新城疫苗免疫應(yīng)答的影響

邢玉娟+王建國(guó)+陳玉庫(kù)+胡元亮+王德云+蔡丙嚴(yán)

摘要： 將14日齡非免疫健康羅曼蛋公雞594羽隨機(jī)均分為11組，1～9組分別為OM-APS、OM和APS的高、中、低劑量組，10組為免疫對(duì)照組，11組為空白對(duì)照組。除空白對(duì)照組外均用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、點(diǎn)眼免疫，28日齡重復(fù)免疫。在首次免疫的同時(shí)，1～9組分別口服高、中、低劑量藥物，疫苗對(duì)照組和空白對(duì)照組口服等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3 d。分別于14、21、28、35、42日齡采血，用MTT法測(cè)定T淋巴細(xì)胞增殖的變化，用β-微量法測(cè)定血清抗體效價(jià)變化。于14、21、28、35日齡，每組隨機(jī)抽取4羽，稱體質(zhì)量，剖殺，摘取法氏囊和脾臟并稱體質(zhì)量，計(jì)算免疫器官指數(shù)。于69日齡用新城疫強(qiáng)毒攻毒，觀察保護(hù)率。結(jié)果表明，OM-APS、OM、APS的高、中濃度在各時(shí)間點(diǎn)均能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖；OM-APS高、中濃度在各時(shí)間點(diǎn)抗體效價(jià)明顯高于免疫對(duì)照組；OM-APS的高、中、低濃度在各時(shí)間點(diǎn)的脾指數(shù)、高、中濃度各時(shí)間點(diǎn)的法氏囊指數(shù)均明顯高于免疫對(duì)照組；OM-APS、APS的高、中、低濃度，OM中、低濃度的攻毒保護(hù)率均高于或明顯高于免疫對(duì)照組。

關(guān)鍵詞： 中藥成分復(fù)方；T淋巴細(xì)胞增殖；新城疫疫苗；免疫應(yīng)答；抗體效價(jià)；免疫器官指數(shù)；攻毒保護(hù)率

中圖分類(lèi)號(hào)： S853.74 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0182-05

研究證明，中藥作為一種免疫增強(qiáng)劑，具有來(lái)源廣泛、效果顯著、無(wú)毒副作用等優(yōu)勢(shì)，不僅能克服油乳類(lèi)、鋁膠類(lèi)化學(xué)佐劑副作用大、局部刺激重、致癌、制備和使用麻煩或不能足提高弱抗原的免疫原性等弊病 ，而且能顯著增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育和細(xì)胞因子的分泌[3-4]。

在以前的研究中，筆者首先通過(guò)體外試驗(yàn)篩選出OM、APS等中藥成分，這些成分具有顯著抑制NDV病毒增殖的作用，然后比較了中藥成分復(fù)方體外抗NDV感染的效果。結(jié)果表明，中藥成分復(fù)方高、中、低濃度能顯著抑制NDV感染CEF[5]。并通過(guò)臨床試驗(yàn)比較了中藥成分復(fù)方對(duì)雛雞人工感染新城疫的療效，結(jié)果表明，中藥成分復(fù)方在攻毒前、攻毒時(shí)和攻毒后3種給藥方式，均能顯著降低受試雞的死亡率，提高血清NDV抗體效價(jià)，減輕死亡雞的器官出血[6]。

本試驗(yàn)在測(cè)定了4種中藥成分及其4個(gè)復(fù)方對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測(cè)定了中藥成分復(fù)方及其組分藥配合新城疫疫苗免疫后雛雞外周血T淋巴細(xì)胞增殖的變化，血清抗體效價(jià)的變化，對(duì)法氏囊指數(shù)、脾指數(shù)以及對(duì)攻毒保護(hù)率的影響，通過(guò)各中藥組和免疫對(duì)照組、空白對(duì)照組差異比較的觀察，進(jìn)一步探討中藥成分復(fù)方免疫增強(qiáng)的作用機(jī)理，為研制中藥成分免疫增強(qiáng)劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物準(zhǔn)備

根據(jù)以前的試驗(yàn)結(jié)果[5-6]，分別用雙蒸水將OM、APS和OM-APS（OAP）稀釋成高（4 mg/mL）、中（2 mg/mL）、低（1 mg/mL）3種濃度，常規(guī)消毒后備用。

1.2 疫苗和病毒

新城疫Ⅳ系（newcastle disease virus Ⅳ strain，NDV-Ⅳ）疫苗，中牧股份南京藥械廠生產(chǎn)，批號(hào)753-3。新城疫檢測(cè)抗原，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)研究室提供。新城疫強(qiáng)毒（newcastle disease virus，NDV）E01株，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所禽病研究室提供。將病毒按常規(guī)方法接種9日齡SPF雞胚，恒溫培養(yǎng)72 h，收獲尿囊液，按Reed-Muench法[7]測(cè)定EID50為10-8.83。

1.3 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品，按說(shuō)明書(shū)用三蒸水配制后過(guò)濾除菌，分裝，4 ℃保存，臨用前加入犢牛血清達(dá)5%和青霉素、鏈霉素各100 IU/mL；植物血凝素（PHA），上海伊華科技有限公司產(chǎn)品，用RPMI1640培養(yǎng)液配制成 0.1 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后-20 ℃保存；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）溶液，Amresco公司產(chǎn)品，用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，使終濃度為5.0 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后4 ℃冰箱避光保存；淋巴細(xì)胞分離液，上海恒信化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞裂解液，二甲亞砜（DMSO），分析純，蘇州正興化工研究院產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

1日齡非免疫健康羅曼蛋公雞594羽，購(gòu)自湯泉農(nóng)墾種雞場(chǎng)。試驗(yàn)期間采用籠養(yǎng)，全價(jià)飼料，自由采食和飲水，1～14日齡采用紅外燈保溫，全日制光照。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

雛雞飼養(yǎng)至14日齡（平均體質(zhì)量95 g，平均母源抗體效價(jià)3.3log2時(shí)，隨機(jī)均分為11組（每組54羽）。1～9組為OAP高劑量組（OAPH）、OAP中劑量組（OAPM）、OAP低劑量組（OAPL）、OM高劑量組（OMH）、OM中劑量組（OMM）、OM低劑量組（OML）、APS高劑量組（APSH）、APS中劑量組（APSM）和APS低劑量組（APSL），10組為疫苗對(duì)照組，11組為空白對(duì)照組。除空白對(duì)照組外均用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、點(diǎn)眼免疫，每羽4羽份。28日齡重復(fù)免疫。在首次免疫的同時(shí)，3個(gè)中藥復(fù)方組分別口服高、中、低劑量的OAP復(fù)方，每羽1.0 mL，6個(gè)單味藥對(duì)照組分別口服高、中、低劑量的OM和APS，每羽1.0 mL，免疫對(duì)照組和空白對(duì)照組口服等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3 d。分別于14、21、28、35、42日齡，每組隨機(jī)抽取4羽，無(wú)菌心臟采血（每羽4.0 mL），肝素抗凝，測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞增殖；每組隨機(jī)抽取10羽翼靜脈采血，分離血清，用β-微量法測(cè)定HI抗體效價(jià)；在14、21、28、35日齡，每組隨機(jī)抽取4羽，稱質(zhì)量，剖殺，摘取法氏囊和脾臟并稱質(zhì)量，計(jì)算免疫器官指數(shù)（免疫器官質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）；于69日齡用新城疫強(qiáng)毒攻毒，觀察保護(hù)率。endprint

1.6 淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定方法

采用MTT法[3-4，8]。將抗凝血樣（每羽4.0 mL）用Hanks液稀釋1倍，小心加在淋巴細(xì)胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min，吸取中間云霧狀白細(xì)胞層，用無(wú)血清RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液洗2遍，1 500 r/min離心15 min。臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)活細(xì)胞大于90%后，用RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為 2.5×106個(gè)/mL，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（德國(guó)Nunclon公司生產(chǎn)）中，80 μL/孔，再加20 μL/孔 PHA，每個(gè)樣品重復(fù)4孔，然后置于39.5 ℃、5% CO2條件下（CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Revco公司產(chǎn)品）培養(yǎng)44 h，取出，加入MTT溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加裂解液100 μL/孔，將細(xì)胞板置于微量振蕩器（75-2A型，上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn)）上振蕩 5 min 使沉淀完全溶解，在酶聯(lián)免疫儀（DG-3022型，中國(guó)華東電子管廠生產(chǎn)）上檢測(cè)570 nm處的吸光度（D570 nm）作為T(mén)淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。

1.7 抗體效價(jià)測(cè)定方法

在96孔微量血凝板上，從左到右各加50 μL/孔 PBS液，再向每排的第1孔加入50 μL待檢血清，依次向后倍比稀釋直至第12孔，然后向每孔加入50 μL 4個(gè)單位抗原，在微量振蕩器上振蕩混勻后置于溫箱中感作20 min；取出，加入50 μL/孔雞紅細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性血清、陰性血清及空白對(duì)照孔。振蕩混勻后置于37 ℃溫箱中感作30 min，待對(duì)照孔紅細(xì)胞已經(jīng)沉淀時(shí)觀察結(jié)果[7]。

1.8 攻毒保護(hù)率測(cè)定方法

除空白對(duì)照組外，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將新城疫病毒E01株稀釋100倍，肌肉注射0.5 mL/羽。每天記錄各組死亡數(shù)，死亡雞剖檢，至攻毒后8 d停止死亡時(shí)計(jì)算死亡率和攻毒保護(hù)率。

1.9 數(shù)據(jù)處理

淋巴細(xì)胞D570 nm值、HI效價(jià)和免疫器官指數(shù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用SPSS軟件11.0統(tǒng)計(jì)分析，比較各時(shí)間點(diǎn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抗體效價(jià)和免疫器官指數(shù)的差異性。死亡率和攻毒保護(hù)率用t檢驗(yàn)比較各組之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 淋巴細(xì)胞增殖的變化

各時(shí)間點(diǎn)D570 nm值均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05）。[HJ1.3mm]OAPH、OAPM、OMH、OMM、APSH、APSM在各時(shí)間點(diǎn)，OAPL和APSL在21、28、35、42日齡，OML在21、28、42日齡的D570 nm值顯著高于免疫對(duì)照組。

OAPH在各時(shí)間點(diǎn)D570 nm值均顯著高于OMH和APSH（P<0.05）；OAPM在28日齡D570 nm值高于APSM，但差異不顯著，其余各時(shí)間點(diǎn)D570 nm 值均明顯高于OMM和APSM（P<0.05）；各復(fù)方組和OMH、APSH在21日齡D570 nm值達(dá)到高峰，其余各單味藥對(duì)照組在28日齡達(dá)到高峰（表1）。

2.2 抗體效價(jià)的變化

各時(shí)間點(diǎn)抗體效價(jià)均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05）；OAPH、OAPM在14日齡，OAPH、OAPM、OAPL、APSH、APSM、APSL、OMH、OMM在21日齡，OAPH、OAPM、OAPL、OMM和APSM在28日齡，OAPH、OAPM、OAPL、OMM、APSH、APSM在35

日齡，OAPH、OAPM、APSM在42日齡抗體效價(jià)顯著高于免疫對(duì)照組（P<0.05）。

OAPH的抗體效價(jià)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于OMH和APSH（P<0.05）；OAPM抗體效價(jià)在21、28、35、42日齡顯著高于OMM，在21、28、35日齡顯著高于APSM（P<005）；OAPL抗體效價(jià)在28日齡顯著高于OML（P<0.05，表2）。

2.3 免疫器官指數(shù)的變化

2.3.1 法氏囊指數(shù)的變化

OML、OPAL免疫對(duì)照組和空白對(duì)照組的法氏囊指數(shù)在21日齡達(dá)到峰值，其他各組在28日齡達(dá)到峰值；各藥物組及免疫對(duì)照組法氏囊指數(shù)均顯著高于空白對(duì)照（P<0.05）；OAPH、OAPM、OMM、OML、APSH、APSM、APSL在各時(shí)間點(diǎn)，OMH在21、28日齡，OAPL在14、21、28日齡法氏囊指數(shù)顯著高于免疫對(duì)照組（P<0.05）。OAPH的法氏囊指數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于OMH，在28、35日齡顯著高于APSH，OAPM的法氏囊指數(shù)在35日齡顯著高于APSM（表3）。

2.3.2 脾指數(shù)的變化

OAPH、OAPM、OAPL、OMM、APSH、APSM在各時(shí)間點(diǎn)，OMH在14、35日齡，OML、APSL在14、21、35日齡脾指數(shù)顯著高于空白對(duì)照（P<0.05）；OAPH、OAPM、OAPL、OMM、APSH、APSM在各時(shí)間點(diǎn)，OML在21日齡，APSL在14、21日齡的脾指數(shù)均顯著高于免疫對(duì)照組（P<0.05）。

OAPH在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于OMH，OAPM在21、28、35日齡顯著高于OMM，在28日齡顯著高于APSM，OAPL在14、28日齡顯著高于OML（表4）。

2.4 攻毒保護(hù)率的變化

攻毒后24 h，雞出現(xiàn)精神萎靡，蹲伏籠角；食欲減退或廢絕，垂頭縮頸，羽毛松散、粗亂，翅膀下垂，閉眼昏睡，伸頸張口呼吸等癥狀，少數(shù)病雞出現(xiàn)神經(jīng)癥狀；腹瀉，排黃白色或黃綠色水樣糞便。48 h開(kāi)始出現(xiàn)死亡，72～96 h各組死亡數(shù)均達(dá)到高峰，隨后開(kāi)始下降，至攻毒后192 h停止死亡。死亡的雞剖檢，可見(jiàn)典型的新城疫變化，喉頭、氣管有多量黏液，黏膜有出血點(diǎn)或出血斑；腺胃黏膜腫脹，乳頭出血；盲腸扁桃體腫大、出血；腸管?chē)?yán)重出血；脾腫大、出血。

各組保護(hù)率極顯著高于空白對(duì)照組（P<0.001）；OAP高、中劑量組保護(hù)率顯著高于免疫對(duì)照組（P<0.05），APS的高、中、低濃度、OM中、低濃度保護(hù)率均高于免疫對(duì)照組，由高到低依次為OAPM、OAPH、APSH、APSM、OMM、OAPL、OML和APSL（表5）。endprint

3 討論

3.1 中藥成分復(fù)方及其組分藥對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響

淋巴細(xì)胞增殖是反映機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一個(gè)重要指標(biāo)[9]。細(xì)胞免疫是通過(guò)致敏淋巴細(xì)胞與相應(yīng)抗原作用而發(fā)揮抗病原體感染、抗腫瘤、幫助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體等作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，9個(gè)試驗(yàn)藥物組中，除OAPL、OML、APSL在14日齡，OML在35日齡外，其余各組、各時(shí)間點(diǎn)的D570 nm值均顯著高于免疫對(duì)照組。說(shuō)明復(fù)方、APS和OM在合適的劑量下均能刺激淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞免疫，其中以O(shè)APM、OAPH的效果最好。

3.2 中藥成分復(fù)方及其組分藥對(duì)新城疫疫苗免疫應(yīng)答的影響

血清抗體效價(jià)反映機(jī)體體液免疫狀態(tài)[10]，體液免疫是機(jī)體抗御感染的主要因素之一，通過(guò)抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)而起到抗菌、抗病毒、抗外毒素等多種作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，OAPH、OAPM和APSM在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，OMM在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，OAPL和APSH在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，OMH和APSL在1個(gè)時(shí)間點(diǎn)的抗體效價(jià)顯著高于免疫對(duì)照組。表明OAP、APS和OM在合適的劑量下均能刺激抗體產(chǎn)生，提高機(jī)體體液免疫水平，其中以O(shè)APH、OAPM和APSM的作用最強(qiáng)。

3.3 中藥成分復(fù)方及其組分藥對(duì)免疫器官指數(shù)的影響

一般認(rèn)為，免疫器官指數(shù)降低為免疫抑制所致，而免疫器官指數(shù)增加則為免疫增強(qiáng)的表現(xiàn)[11]。在本試驗(yàn)中，OAPH、OAPM在各時(shí)間點(diǎn)法氏囊指數(shù)、脾指數(shù)均明顯高于免疫對(duì)照和空白對(duì)照組，OAPL在14、21、28日齡法氏囊指數(shù)和各時(shí)間點(diǎn)的脾指數(shù)顯著高于免疫對(duì)照組。除OMH在14、35日齡以及OAPL在35日齡法氏囊指數(shù)高于免疫對(duì)照但差異不顯著外，其余各藥物組法氏囊指數(shù)均顯著高于免疫對(duì)照組（P<0.05）。在脾指數(shù)方面，OMH在各時(shí)間點(diǎn)，OML在14、28、35日齡，APSL在28、35日齡外，其余各組、各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于免疫對(duì)照組（P<0.05）。表明中藥成分復(fù)方及其組分藥能增加免疫器官質(zhì)量，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

3.4 中藥成分復(fù)方及其組分藥對(duì)免疫保護(hù)力的影響

攻毒保護(hù)率直接反映動(dòng)物的抗病力，中藥可直接殺滅侵入機(jī)體的病毒，或通過(guò)增強(qiáng)疫苗的免疫應(yīng)答而提高保護(hù)率[12-14]。本試驗(yàn)將各組雞在69日齡用NDV強(qiáng)毒進(jìn)行攻毒，OAPH、OAPM的保護(hù)率分別達(dá)到91.82%、95.72%，顯著高于免疫對(duì)照組（P<0.05），APS的3個(gè)濃度組、OMM、OML和OAPL的攻毒保護(hù)率也高于免疫對(duì)照組，表明OAP及中藥組能顯著提高或提高新城疫疫苗的免疫應(yīng)答，從而提高雛雞對(duì)新城疫的抗病能力。

3.5 復(fù)方及其組分藥增強(qiáng)免疫作用有一定的量效關(guān)系

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OAP增強(qiáng)免疫作用有一定的量效關(guān)系。在促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖方面，OAPH、OAPM在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于免疫對(duì)照組，而OAPL在14日齡則與免疫對(duì)照組無(wú)顯著差異。OM和APS的高、中劑量組在各時(shí)間點(diǎn)與免疫對(duì)照組相比差異顯著，而低劑量組在14日齡與免疫對(duì)照組無(wú)顯著差異，是否因?yàn)閯┝窟^(guò)小，不足以刺激機(jī)體產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞，還有待于進(jìn)一步研究；在提高血清抗體效價(jià)方面，OAPH、OAPM在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于免疫對(duì)照組，OAPL在21、28和35日齡顯著高于免疫對(duì)照組；在提高法氏囊指數(shù)方面，OAPH、OAPM各時(shí)間點(diǎn)顯著高于免疫對(duì)照，OAPL在14、21、28日齡顯著高于免疫對(duì)照，在35日齡與對(duì)照組相比較差異不顯著?？紫榉宓仍谟^察9種中藥成分對(duì)新城疫Ⅳ系疫苗免疫雛雞血清中血凝抑制抗體水平的影響，也得到相似的結(jié)果[15-16]。

3.6 復(fù)方增強(qiáng)免疫作用優(yōu)于單味組分藥

OAP是由OM和APS組成的復(fù)方，其增強(qiáng)免疫作用優(yōu)于單味組分藥，表明2種組分藥有協(xié)同作用。在促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖方面，OAPH在各時(shí)間點(diǎn)D570 nm值均顯著高于OMH和APSH（P<0.05）。OAPM在28日齡D570 nm值高于APSM，但差異不顯著，其余各時(shí)間點(diǎn)D570 nm值均顯著高于OMM和APSM（P<0.05）。Wang等觀察當(dāng)歸多糖、黃芪多糖及其復(fù)方等對(duì)培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖、抗體生成、細(xì)胞因子分泌的影響，也得到相似結(jié)果[17-18]。Fan等研究中藥成分黃酮及其復(fù)方增強(qiáng)免疫作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)，復(fù)方的作用效果優(yōu)于單味成分[19]。

在提高血清抗體效價(jià)方面，OAPH抗體效價(jià)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于OMH和APSH（P<0.05）；OAPM抗體效價(jià)在21、28、35、42日齡顯著高于OMM，21、28、35日齡顯著高于APSM（P<0.05）；OAPL抗體效價(jià)在28日齡顯著高于OML（P<0.05）。

在提高免疫器官指數(shù)方面，OAPH的法氏囊指數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于OMH，在28、35日齡顯著高于APSH；OAPM的法氏囊指數(shù)在35日齡顯著高于OMM和APSM；在提高脾指數(shù)方面，OAPH在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于OMH，OAPM在21、28、35日齡顯著高于OMM，在28日齡顯著高于APSM，OAPL在14、28日齡顯著高于OMM。表明2種組分藥有協(xié)同作用。

綜合以上結(jié)果可見(jiàn)，OAP能顯著增強(qiáng)雛雞對(duì)新城疫疫苗的免疫應(yīng)答，中、高劑量的效果較好，顯著優(yōu)于單味組分。鑒于中、高劑量的效果多差異不顯著，推薦臨床使用OAP中劑量配合疫苗使用，可作為新型免疫增強(qiáng)劑的候選方。

參考文獻(xiàn)：

[1] 潘杭君，孫紅祥. 免疫佐劑的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)獸藥雜志，2004，38（1）：32-37.

[2]龔曉明，吳耀妹. 免疫佐劑研究的現(xiàn)狀與趨勢(shì)[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，1996，30（1）：41-43.

[3]郭振環(huán)，胡元亮，馬 霞，等. 硫酸化香菇多糖對(duì)新城疫疫苗免疫效果的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（1）：76-80.endprint

[4]Ma X，Guo Z H，Wang D Y，et al. Effects of sulfated polysaccharides and their prescriptions on immune response of ND vaccine in chicken[J]. Carbohydrate Polymers，2010，82（1）：9-13.

[5]陳玉庫(kù)，邢玉娟，蔡丙彥，等. 四種中藥成分復(fù)方抗NDV感染CEF細(xì)胞篩選效果分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（5）：176-179.

[6]邢玉娟，陳玉庫(kù)，蔡丙彥，等. 氧化苦參堿-黃芪多糖復(fù)方防治雞新城疫的效果觀察[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2009（1）：91-93.

[7]殷 震，劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)[M]. 2版.北京：科學(xué)出版社，1997.

[8]劉 釗，楊占秋，肖 紅，等. MTT法在抗病毒藥物篩選中的應(yīng)用[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2004，25（3）：333-336.

[9]Huang Y，Jiang C，Hu Y，et al. Immunoenhancement effect of rehmannia glutinosa polysaccharide on lymphocyte proliferation and dendritic cell[J]. Carbohydrate Polymers，2013，96（2）：516-521.

[10] Fan Y，Ma L，Zhang W，et al. Microemulsion can improve the immune-enhancing activity of propolis flavonoid on immunosuppression and immune response[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2014，63：126-132.

[11]Grossman C J. Interrationbetween the gonadal steroids and the immune system[J]. Science，1995，227：261-357.

[12]Wu X N，Wang G J. Experimental studies of oxymatrine and its mechanisms of action in hepatitis B and C viral infections[J]. Chinese Journal of Digestive Diseases，2004，5（1）：12-16.

[13]許 斌，周雙宬，黃玉仙. 氧化苦參堿在鴨原代肝細(xì)胞中抗鴨乙肝病毒（DHBV）作用的研究[J]. 病毒學(xué)報(bào)，2006，22（5）：369-374.

[14]何 誠(chéng)，楊 明，楊建民，等. 中藥制劑SHY對(duì)新城疫、禽流感H9、H5亞型病毒的抑制和攻毒保護(hù)效果[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，10（6）：7-10.

[15]孔祥峰，胡元亮，李祥瑞，等. 9種中藥成分對(duì)新城疫Ⅳ系疫苗免疫雛雞血清中血凝抑制抗體水平的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35（4）：468-472.[HJ1.7mm]

[16]聶小華，史寶軍，敖宗華，等. 黃芪活性成分的提取及其對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響[J]. 無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22（4）：49-51.

[17]Wang D，Hu Y，Sun J，et al. Comparative study on adjuvanticity of compound Chinese herbal medicinal ingredients[J]. Vaccine，2005，23（28）：3704-3708.

[18]Wang D，Li X，Xu L，et al. Immunologic synergism with IL-2 and effects of cCHMIs on mRNA expression of IL-2 and IFN-γ in chicken peripheral T lymphocyte[J]. Vaccine，2006，24（49/50）：7109-7114.

[19]Fan Y，Hu Y，Wang D，et al. Epimedium polysaccharide and propolis flavone can synergistically stimulate lymphocyte proliferation in vitro and enhance the immune responses to ND vaccine in chickens[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2010，47（2）：87-92.endprint