甘薯黑斑病抗性鑒定中黑斑病菌培養(yǎng)方法研究

禹陽+賈趙東+馬佩勇+郭小丁+謝一芝+邊小峰

摘要： 黑斑病是甘薯生產(chǎn)上的重要病害，選育抗黑斑病的甘薯品種是防治黑斑病的重要途徑之一。黑斑病抗性鑒定是甘薯抗病育種的基礎(chǔ)，然而目前采用的甘薯黑斑病抗性鑒定方法仍存在不足，尤其是病原菌的純化和準(zhǔn)備。利用甘薯液體培養(yǎng)基對黑斑病菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，成功接種蘇薯8號和華東51-93并致病。采用該培養(yǎng)方法連續(xù)2年對蘇渝303等8個(gè)品種進(jìn)行黑斑病抗性鑒定，鑒定結(jié)果較為穩(wěn)定一致，能有效反映甘薯品種對黑斑病的抗性水平。該培養(yǎng)方法科學(xué)高效，操作簡單，不易污染，從而可為甘薯抗黑斑病品種選育提供高效精準(zhǔn)的抗性鑒定方法。

關(guān)鍵詞： 甘薯；黑斑??；病原菌培養(yǎng)；抗性鑒定

中圖分類號： S435.313+.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0120-02

由甘薯長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted）侵染引起的甘薯黑斑?。╯weetpotato black rot）是甘薯生產(chǎn)上一種重要病害，在我國各甘薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。該病能造成甘薯儲藏時(shí)爛窖，育苗時(shí)爛床和死苗，對甘薯生產(chǎn)影響極大。其中病薯毒害較大，如用病薯喂養(yǎng)牲畜，會(huì)發(fā)生氣喘病而死亡；用病薯釀酒，則發(fā)酵遲緩并降低乙醇的產(chǎn)量與質(zhì)量，嚴(yán)重制約甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。甘薯黑斑病可通過種薯、薯苗及土壤等多種途徑傳播[2]，很難徹底根除，因此選育抗黑斑病甘薯品種是防治黑斑病的重要途徑之一。

黑斑病抗性鑒定是甘薯抗病育種的基礎(chǔ)，目前生產(chǎn)上采用的鑒定方法主要有田間人工接種鑒定、田間自然誘發(fā)鑒定、室內(nèi)薯塊人工接種鑒定、室內(nèi)薯苗人工接種鑒定等。由于田間鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)工、受外界環(huán)境影響較大，組織幼嫩的薯苗接種會(huì)致發(fā)病較重、不易區(qū)分品種抗性等級，一般多采用室內(nèi)薯塊人工接種鑒定法[3-4]。然而此法在使用過程中仍有不足，尤其是病原菌的擴(kuò)繁效率和純度。本研究通過利用甘薯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)黑斑病菌，極大程度改善了傳統(tǒng)薯片法的缺陷，可為甘薯黑斑病的高效精準(zhǔn)鑒定提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用于黑斑病菌活力鑒定的蘇薯8號和華東51-93，以及用于黑斑病抗性鑒定的蘇渝303等8個(gè)甘薯品種均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所甘薯研究室提供和保存。

1.2 病原菌分離和純化

從田間采集黑斑病發(fā)病薯塊，通過組織分離法分離黑斑病菌。分離時(shí)洗去薯塊表面泥土，并用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，在超凈工作臺上將病斑表皮去除，取病斑部并切成小塊。將病斑部接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上培養(yǎng)，經(jīng)分離純化和柯赫氏法則驗(yàn)證確定。

1.3 黑斑病菌的培養(yǎng)和孢子懸浮液制備

取2 g薯塊（薯塊顏色白色為宜），加水煮沸并攪拌，使薯塊徹底勻漿在溶液中，紗布過濾，將濾液高壓滅菌制備甘薯液體培養(yǎng)基。將分離純化的黑斑病菌接入甘薯液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床150～200 r/min培養(yǎng)20～24 h。滅菌紗布過濾去除菌絲后，6 000 r/min離心5 min，之后用無菌水懸浮獲得孢子懸浮液，并將其D600 nm調(diào)至1.0。

1.4 病原菌接種與薯塊處理

采用針刺接種法接種，用醫(yī)用注射針頭蘸取配好的菌液，穿刺測試的薯塊進(jìn)行接種，每個(gè)薯塊接種15個(gè)點(diǎn)（注意：每針刺1次，針頭需蘸取菌液），深度0.5 cm。接種后的薯塊裝入消毒的塑料箱中，加蓋消毒紗布，置于25～28 ℃的恒溫室中，每天上午、下午各用溫水澆濕覆蓋紗布1次進(jìn)行保濕。

1.5 發(fā)病情況調(diào)查

每個(gè)測試品種重復(fù)接種4～10次，接種15 d后測量薯塊的病斑表面直徑，計(jì)算平均病斑直徑并確定其抗病等級。

具體評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：直徑<1.0 cm，高抗；1.0 cm≤直徑<1.3 cm，抗?。?.3 cm≤直徑<1.6 cm，中抗；1.6 cm≤直徑<1.9 cm，感??；直徑≥1.9 cm，高感。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用甘薯液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)黑斑病菌的活力鑒定

將分離得到的黑斑病菌接入甘薯液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，紗布過濾離心后制成孢子懸浮液。經(jīng)顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，孢子懸浮液中雜質(zhì)較少，且孢子形態(tài)正常（圖1-A）。為鑒定孢子是否有活力，采用室內(nèi)薯塊人工接種法對蘇薯8號和華東51-93進(jìn)行黑斑病菌接種預(yù)試驗(yàn)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種2 d后在蘇薯8號和華東51-93的薯塊表面即出現(xiàn)黑斑病病斑，且隨著接種天數(shù)的延長病斑越明顯，接種10 d后的病菌在甘薯薯塊縱切面有不同程度的致病（圖1-B）。該結(jié)果證明，通過甘[CM（25]薯液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)的黑斑病菌能夠明顯減少雜菌污

染，孢子活力大，可以成功使甘薯發(fā)病，能夠用于生產(chǎn)上的甘薯黑斑病抗性鑒定。

2.2 利用液體培養(yǎng)黑斑病菌進(jìn)行品種抗性鑒定

利用甘薯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)黑斑病菌的方法，于2016、2017年采用室內(nèi)薯塊人工接種法對蘇渝303等8個(gè)品種進(jìn)行黑斑病抗性鑒定。其中鑒定出抗病品種2個(gè)，分別為寧 W50-20 和南京1063；中抗品種4個(gè)，分別是蘇渝303、寧紫1號、徐薯36和寧104-1；感病品種2個(gè)，分別為徐紫8號和寧W50-13。通過分析2年的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，利用甘薯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)黑斑病菌進(jìn)行甘薯黑斑病抗性鑒定的結(jié)果較為穩(wěn)定一致，說明該培養(yǎng)方法能夠科學(xué)可靠地反映供試材料的抗病性。

3 討論與結(jié)論

甘薯黑斑病的傳播途徑較多，在生產(chǎn)上屬于頑固性病害，難以徹底根除，因此選育抗病品種是防治黑斑病的重要途徑之一。黑斑病抗性鑒定作為甘薯抗病性研究的重要環(huán)節(jié)，其科學(xué)有效性將直接影響甘薯抗黑斑病品種的選育。

目前，生產(chǎn)上普遍采用傳統(tǒng)的薯片法培養(yǎng)黑斑病菌進(jìn)行甘薯黑斑病抗性的室內(nèi)薯塊人工接種鑒定[5]，即將切好的薯片放入加水稀釋的搗爛薯塊黑斑病病斑部，內(nèi)浸后晾干表面水分，在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)5～6 d至薯片表面長滿淺灰色的分生孢子，之后制成孢子懸浮液以接種。在這個(gè)過程中，不僅薯片易腐爛，也容易混入雜菌，且耗時(shí)較長，因此無法科學(xué)精準(zhǔn)地對甘薯品種黑斑病的抗性作出評價(jià)。液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)真菌孢子進(jìn)行植物抗病性鑒定的方法已在多種農(nóng)作物中被廣泛應(yīng)用，該方法具有周期短、污染少、靈敏性高等特點(diǎn)，為植物抗病品種選育提供了切實(shí)可靠有效的指導(dǎo)[6-7]。借鑒這些農(nóng)作物的真菌病害鑒定方法，本研究對傳統(tǒng)的甘薯黑斑病抗性鑒定方法進(jìn)行了改進(jìn)。與傳統(tǒng)的薯片法相比，利用甘薯液體培養(yǎng)基對分離純化的甘薯黑斑病菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)只需 20～24 h，不僅能夠極大縮短黑斑病菌的增殖時(shí)間，而且操作過程簡單、條件可控、不易污染。此外，由此制備的孢子懸浮液中雜菌少，孢子活力強(qiáng)。

采用甘薯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)黑斑病菌的方法，連續(xù)2年對蘇渝303等8個(gè)甘薯品種進(jìn)行黑斑病抗性鑒定的結(jié)果較為穩(wěn)定一致，進(jìn)一步說明該培養(yǎng)方法的鑒定結(jié)果科學(xué)準(zhǔn)確，能夠有效反映甘薯品種對黑斑病的抗性水平，可以為甘薯抗黑斑病品種選育提供高效的抗性鑒定方法。

參考文獻(xiàn)：

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