• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    芒果BCH基因的克隆與表達(dá)

    2018-01-06 19:56陳景鋒趙志常高愛平黃建峰羅睿雄劉寬亮張夢云
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年22期
    關(guān)鍵詞:基因克隆芒果基因

    陳景鋒+趙志常+高愛平+黃建峰+羅睿雄+劉寬亮+張夢云

    摘要: β-胡蘿卜素羥化酶(BCH)基因是催化玉米黃素合成的關(guān)鍵基因,玉米黃素在植物光保護(hù)過程中發(fā)揮著重要的作用。采用RACE方法從黃色的金煌芒果的果皮中克隆得到了1個(gè)BCH基因,該基因全長cDNA序列為 1 160 bp,開放閱讀框?yàn)?88 bp,編碼295個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為32.97 ku,分子等電點(diǎn)為9.51。利用生物信息學(xué)在線分析軟件對(duì)其組成成分、疏水性/親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域以及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析。通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),該基因編碼的蛋白與溫州蜜柑、柚子、大豆、草莓等具有較近的親緣關(guān)系。對(duì)不同芒果品種的BCH基因的表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),紅色的貴妃品種中表達(dá)量較高,而黃色的金煌品種中表達(dá)量較低。

    關(guān)鍵詞: 芒果;β-胡蘿卜素羥化酶(BCH)基因;基因克?。换虮磉_(dá)分析;親緣關(guān)系

    中圖分類號(hào): Q785;S667.701 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2017)22-0024-03

    β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotene hydroxylase,BCH) 基因是催化玉米黃素合成的關(guān)鍵基因。目前,已經(jīng)報(bào)道了從擬南芥、甜橙、南豐蜜橘、甜椒等[1-5]植物中克隆到了該基因。由于BCH在類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵作用,已成為植物類胡蘿卜素遺傳工程改良中的主要目的基因。芒果類胡蘿卜素生物合成途徑中的 BCH基因分離和鑒定研究國內(nèi)外至今未見報(bào)道,BCH在芒果類胡蘿卜素生物合成途徑中具體作用和功能目前還不清楚。本研究中克隆并分析了芒果BCH基因,為進(jìn)一步研究BCH在芒果果實(shí)著色上的調(diào)控功能奠定分子基礎(chǔ),對(duì)揭示 BCH基因在芒果類胡蘿卜素合成及果色形成中的作用具有重要理論意義,為進(jìn)一步創(chuàng)制高胡蘿卜素含量新種質(zhì)資源、開展芒果類胡蘿卜素品質(zhì)育種提供了理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    分別用刀片切取桂七芒果完全成熟的綠果皮、金煌芒果完全成熟的黃色果皮、貴妃芒果完全成熟的紅色果皮,切碎放入采樣袋中液氮速凍后,立即放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 芒果果皮總RNA提取 采用植物RNA提取試劑盒提取芒果果皮總RNA,用DNase試劑盒進(jìn)行基因組DNA消除,RNase-free無菌水溶解,采用SMARTerTM RACE Amplification Kit(Clontech)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

    1.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 擴(kuò)增條件為:94 ℃ 4 min;94 ℃ 50 s,50 ℃ 50 s,72 ℃ 2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。 反應(yīng)體系為25 μL,其中含10×PCR buffer(含Mg2+) 2.5 μL、25 ng DNA模板、20 μmol引物、1.0 U Taq DNA聚合酶、5.0 mmol dNTPs。

    1.3 BCH基因全長cDNA序列的獲得

    以合成的 cDNA 為模板,根據(jù)已知的BCH基因片段設(shè)計(jì)cDNA 3′-RACE和5′-RACE引物,進(jìn)行3′和5′端的擴(kuò)增。將目的基因片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定及測序,并根據(jù)得到的cDNA 3′ 端和5′末端的序列結(jié)果拼接BCH的全長cDNA,設(shè)計(jì)特異引物,進(jìn)行全長cDNA序列的擴(kuò)增。

    1.4 BCH基因生物信息學(xué)分析

    根據(jù)BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)登錄的BCH蛋白序列進(jìn)行氨基酸序列的同源性分析,用DNAMAN軟件進(jìn)行序列多重比對(duì),并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹推斷其在進(jìn)化過程中親緣關(guān)系。采用bioedit軟件對(duì)BCH蛋白中各個(gè)氨基酸的含量、親水/疏水性進(jìn)行了分析。WoLFPSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)軟件進(jìn)行定位預(yù)測,采用Swissmodel(http://swissmodel.expasy.org/)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。

    1.5 表達(dá)分析

    分別提取桂七、金煌、貴妃芒果果皮的RNA,反轉(zhuǎn)為cDNA 并采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR的擴(kuò)增。RT-PCR分析采用的內(nèi)參引物序列為:actin-F,5′-AATGG AACTGGAATGGTCAAGGC-3′;actin-R,5′-TGCCAGATCT TCTCCATGTCATCCCA-3′。目的基因擴(kuò)增采用的引物為:BCH-F,5′ -CAGCATAGCCCATATAGCACTC-3′;BCH-R,5′-CAATGGAGCCGATATAAAACTAT-3′。PCR 產(chǎn)物在10%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,并采用Quantity One 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,作出相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 BCH基因的獲得

    根據(jù)得到金煌芒果BCH基因的3′端和5′端序列信息進(jìn)行拼接,最后得到BCH基因的全長cDNA序列。設(shè)計(jì)特異引物,進(jìn)行全長cDNA序列擴(kuò)增,將電泳條帶回收測序后得到BCH基因的cDNA全長序列,為1160 bp,分析發(fā)現(xiàn)開放閱讀框?yàn)?888 bp,編碼295個(gè)氨基酸序列。通過NCBI上已經(jīng)登錄的擬南芥、柚子、大豆、葡萄的BCH蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)(圖1),發(fā)現(xiàn)克隆的基因?yàn)锽CH基因。

    2.2 部分生物信息學(xué)分析

    采用bioedit軟件對(duì)芒果BCH蛋白中各個(gè)氨基酸的含量進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該蛋白丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)和纈氨酸(Val)的含量較高(圖2),用NCBI 上的CDD(conserved domain database,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)數(shù)據(jù)庫分析其氨基酸序列中可能有的蛋白功能結(jié)構(gòu)域,結(jié)果表明該蛋白有1個(gè)典型的FA-hydroxylase superfamily(脂肪酸羥化酶超家族) 保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。對(duì)其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)芒果BCH蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和β-折疊為主,也具有少量的α-螺旋結(jié)構(gòu)(圖4)。采用bioedit軟件的Kyte 和Doolittle 算法對(duì)BCH蛋白的親水性/疏水性(正值表示疏水性,負(fù)值表示親水性)進(jìn)行分析,BCH蛋白所含的氨基酸主要介于2.4~-2.3之間(圖5),采用WoLFPSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)軟件對(duì)BCH蛋白進(jìn)行定位預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該基因定位在葉綠體中,采用Swissmodel(http://swissmodel.expasy.org/)在線軟件對(duì)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,推導(dǎo)出該蛋白可能的三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)型(圖6)。采用DNAMAN軟件進(jìn)行親緣關(guān)系聚類分析發(fā)現(xiàn),芒果BCH蛋白與溫州蜜柑、柚子、大豆等植物的蛋白序列聚為一類(圖7)。endprint

    2.3 BCH基因的RT-PCR分析

    分別提取桂七、金煌、貴妃這3種不同著色品種芒果果皮的RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過上述RT-PCR分析的引物進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),該基因在紅色品種貴妃的果實(shí)中表達(dá)較多,綠色品種的桂七果皮中次之,而黃色品種的金煌果皮中相對(duì)表達(dá)較少(圖8),初步推斷BCH基因可能與紅色品種的貴妃果實(shí)中的類胡蘿卜素合成有密切的關(guān)系。

    3 討論

    BCH是玉米黃素生物合成的重要基因,基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征決定其基因的功能和性質(zhì)。通過對(duì)幾個(gè)物種的BCH蛋白的比對(duì)發(fā)現(xiàn)芒果BCH蛋白含有BCH蛋白家族相同的保守序列,即含有一個(gè)脂肪酸羥化酶超家族保守結(jié)構(gòu)域,前人通過對(duì)擬南芥、玉米、水仙等研究發(fā)現(xiàn),也含有相同的保守結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)該基因定位于葉綠體中[6],這與本研究結(jié)果相一致。通過聚類分析表明,芒果BCH基因與柑橘類具有較近的親緣關(guān)系。對(duì)其表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),紅色的貴妃品種中表達(dá)量較高, 而黃色的金煌品種中表達(dá)量較低。孫化雨等對(duì)毛竹的根、幼莖、葉片、葉鞘、節(jié)等部分的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),BCH基因主要在葉片中表達(dá),而根中表達(dá)量較少[7];對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥分析發(fā)現(xiàn),葉片中葉綠素、葉黃素、類胡蘿卜素等含量升高,表明在毛竹中BCH基因的過量表達(dá)促進(jìn)了類胡蘿卜素向玉米黃素轉(zhuǎn)化,使其含量增加,抗脅迫能力增加[8-9]。本研究從金煌芒果果皮中克隆得到了1個(gè)BCH基因,對(duì)該基因在芒果中的功能研究還須要進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證其功能及在對(duì)芒果果實(shí)色澤形成的作用機(jī)理,為深入理解芒果果實(shí)色澤形成多樣性的原因提供理論依據(jù),并為生產(chǎn)中著色不良成因提供改善的技術(shù)支持。

    [HS2][HT8.5H]參考文獻(xiàn):

    [1] Tian L,Magallanes-Lundback M,Musetti V,et al. Functional analysis of beta- and epsilon-ring carotenoid hydroxylases in Arabidopsis[J]. Plant Cell,2003,15(6):1320-1332.

    [2]Sun Z R,Gantt E,Cunningham F X. Cloning and functional analysis of the β-carotene hydroxylase of Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Biological Chemistry,1996,271(40):24349-24352.

    [3]徐昌杰,陳昆松,張上隆,等. 甜橙β-胡蘿卜素羥化酶cDNA克隆及其瞬間反義表達(dá)[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2003,11(6):593-597.

    [4]馮唐鍇,李思光,汪艷璐,等. 南豐蜜橘β-胡蘿卜素羥化酶基因的克隆和序列分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào),2007,27(2):238-243.

    [5]Wolfraim L A,Dhindsa R S. Cloning and sequencing of the cDNA for cas17,a cold acclimation-specific gene of alfalfa[J]. Plant Physiology,1993,103(2):667-668.

    [6]趙大球,曹春燕,孔 芬,等. 植物β-胡蘿卜素羥化酶的生物信息學(xué)分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2010(4):116-121.

    [7]孫化雨,陳 穎,趙韓生,等. 毛竹β-胡蘿卜素羥化酶基因的分子特征及其功能[J]. 林業(yè)科學(xué),2015,51(10):53-59.

    [8]Kim J,Smith J J,Tian L,et al. The evolution and function of carotenoid hydroxylases in Arabidopsis[J]. Plant & Cell Physiology,2009,50(3):463-479.

    [9]Pons E,Alquézar B,Rodríguez A,et al. Metabolic engineering of β-carotene in orange fruit increases its in vivo,antioxidant properties[J]. Plant Biotechnology Journal,2014,12(1):17-27.endprint

    猜你喜歡
    基因克隆芒果基因
    Frog whisperer
    我才不要穿
    小洞會(huì)“咬”人
    小洞會(huì)“咬”人
    三個(gè)小麥防御素基因的克隆及序列分析
    亚洲欧美精品自产自拍| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产精品久久久久成人av| 国产一区亚洲一区在线观看| 免费观看a级毛片全部| 亚洲成人中文字幕在线播放| 九草在线视频观看| 国产视频内射| 色视频www国产| a级毛色黄片| 久久99热6这里只有精品| 丰满少妇做爰视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲美女视频黄频| 国产精品一及| 大码成人一级视频| 国产精品免费大片| 久久综合国产亚洲精品| 一区在线观看完整版| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲精品日本国产第一区| 偷拍熟女少妇极品色| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久精品人妻少妇| 色网站视频免费| 人妻一区二区av| av在线老鸭窝| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 黄色一级大片看看| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美性感艳星| 婷婷色av中文字幕| 亚洲久久久国产精品| 久久久久久九九精品二区国产| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久久久久精品精品| 妹子高潮喷水视频| 欧美人与善性xxx| 国产永久视频网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国精品久久久久久国模美| 亚洲精品第二区| 欧美97在线视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 日韩伦理黄色片| 舔av片在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 九九在线视频观看精品| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲成人手机| 高清在线视频一区二区三区| 国产av精品麻豆| 又大又黄又爽视频免费| 一级二级三级毛片免费看| 精品人妻熟女av久视频| 一个人免费看片子| av在线蜜桃| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 午夜福利视频精品| 久热久热在线精品观看| 97超碰精品成人国产| 身体一侧抽搐| 少妇的逼好多水| 日本欧美国产在线视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 大香蕉久久网| 亚洲国产av新网站| 一区二区三区四区激情视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 日本黄色日本黄色录像| 中文欧美无线码| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| av女优亚洲男人天堂| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲av二区三区四区| 一区在线观看完整版| 天堂8中文在线网| 久久久久性生活片| 午夜视频国产福利| av黄色大香蕉| 国产伦理片在线播放av一区| 国产 一区精品| 超碰av人人做人人爽久久| 免费在线观看成人毛片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 天堂8中文在线网| 国产亚洲一区二区精品| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲一区二区三区欧美精品| 一级二级三级毛片免费看| 韩国av在线不卡| 亚洲精品一二三| 国产精品国产三级专区第一集| 日韩三级伦理在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 老熟女久久久| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久久成人免费电影| 有码 亚洲区| 天天躁日日操中文字幕| 最近的中文字幕免费完整| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品av视频在线免费观看| 美女内射精品一级片tv| 精品人妻一区二区三区麻豆| 人妻夜夜爽99麻豆av| 夫妻午夜视频| 嘟嘟电影网在线观看| 黄色一级大片看看| 精品一区二区免费观看| 午夜福利影视在线免费观看| 精品久久久噜噜| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品一区二区在线不卡| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 夫妻性生交免费视频一级片| 麻豆国产97在线/欧美| 在线免费观看不下载黄p国产| 中文资源天堂在线| 亚洲天堂av无毛| 国产成人免费无遮挡视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 99视频精品全部免费 在线| 日韩三级伦理在线观看| 乱系列少妇在线播放| 熟女av电影| 精华霜和精华液先用哪个| 国产精品久久久久久av不卡| 久久婷婷青草| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产精品嫩草影院av在线观看| 秋霞伦理黄片| 最黄视频免费看| 午夜福利影视在线免费观看| 中文资源天堂在线| 26uuu在线亚洲综合色| 一本久久精品| 国产精品不卡视频一区二区| 精品久久久久久电影网| 在现免费观看毛片| 久热这里只有精品99| 日本av免费视频播放| 美女福利国产在线 | 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲高清免费不卡视频| 国产成人精品一,二区| 男女啪啪激烈高潮av片| 搡老乐熟女国产| 国产精品久久久久久久久免| 国产成人精品久久久久久| 免费av中文字幕在线| 国产一级毛片在线| 欧美区成人在线视频| 日韩av免费高清视频| 韩国高清视频一区二区三区| 插逼视频在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品蜜桃在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 国产成人精品婷婷| 最近2019中文字幕mv第一页| 波野结衣二区三区在线| 777米奇影视久久| 秋霞在线观看毛片| 五月开心婷婷网| 99热网站在线观看| 丝袜脚勾引网站| 国产午夜精品一二区理论片| 免费观看在线日韩| 边亲边吃奶的免费视频| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲综合精品二区| 国产精品熟女久久久久浪| 一本久久精品| 国产精品伦人一区二区| 成人综合一区亚洲| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 一个人免费看片子| 国产在线一区二区三区精| 人妻系列 视频| 少妇精品久久久久久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 新久久久久国产一级毛片| 秋霞伦理黄片| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久99热这里只有精品18| 国产精品欧美亚洲77777| 日本av手机在线免费观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产精品.久久久| 777米奇影视久久| 精品一区二区三区视频在线| 老司机影院毛片| 我的女老师完整版在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产伦理片在线播放av一区| 少妇的逼好多水| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲在久久综合| 久久久久视频综合| av不卡在线播放| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久久久精品久久久久真实原创| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧美精品专区久久| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产熟女欧美一区二区| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩一区二区三区影片| 久久久久久久久久成人| av免费观看日本| 日韩亚洲欧美综合| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久国产亚洲av麻豆专区| h视频一区二区三区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 免费大片18禁| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产永久视频网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 女性生殖器流出的白浆| 欧美bdsm另类| 欧美xxxx性猛交bbbb| 99久久精品一区二区三区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 黄色配什么色好看| 国产成人91sexporn| 天堂俺去俺来也www色官网| 十八禁网站网址无遮挡 | 一级毛片我不卡| 新久久久久国产一级毛片| 交换朋友夫妻互换小说| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 99热这里只有是精品50| 观看av在线不卡| 国产成人免费无遮挡视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 精品久久久久久电影网| 久久精品久久久久久久性| 亚洲色图av天堂| 亚洲精品国产成人久久av| 青春草国产在线视频| 免费观看在线日韩| 麻豆国产97在线/欧美| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久精品久久精品一区二区三区| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品一区二区在线观看99| 精华霜和精华液先用哪个| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 一级a做视频免费观看| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品aⅴ在线观看| 在线观看国产h片| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲av国产av综合av卡| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲自偷自拍三级| a级毛色黄片| 91久久精品电影网| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 欧美97在线视频| 男的添女的下面高潮视频| av国产久精品久网站免费入址| 国产av一区二区精品久久 | 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 亚洲精品色激情综合| 婷婷色av中文字幕| 国产av精品麻豆| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美区成人在线视频| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲成人一二三区av| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 成人午夜精彩视频在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 99久国产av精品国产电影| 精品一区二区三卡| 亚洲伊人久久精品综合| 香蕉精品网在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日韩免费高清中文字幕av| 国产一区有黄有色的免费视频| 草草在线视频免费看| 婷婷色综合www| 成人午夜精彩视频在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 人妻少妇偷人精品九色| 久久久久国产网址| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 少妇人妻一区二区三区视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产精品久久久久久久久免| 日本免费在线观看一区| 国产免费一区二区三区四区乱码| av线在线观看网站| av免费观看日本| 国产片特级美女逼逼视频| 日本免费在线观看一区| 天美传媒精品一区二区| 午夜激情福利司机影院| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久久精品免费免费高清| 精品人妻视频免费看| 一区二区三区乱码不卡18| 一级爰片在线观看| 日本色播在线视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 人体艺术视频欧美日本| av卡一久久| 秋霞伦理黄片| 伦理电影免费视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲天堂av无毛| 免费看av在线观看网站| 大话2 男鬼变身卡| 一区二区三区乱码不卡18| 国产伦理片在线播放av一区| 丰满迷人的少妇在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲国产精品专区欧美| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产精品国产av在线观看| 精品久久久久久电影网| 国产久久久一区二区三区| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产成人精品福利久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日韩电影二区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产v大片淫在线免费观看| 在线观看免费日韩欧美大片 | 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲欧洲日产国产| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产高清三级在线| 黑人高潮一二区| 少妇精品久久久久久久| 欧美bdsm另类| 亚洲精品456在线播放app| 一区二区三区精品91| 国产精品熟女久久久久浪| 国产免费福利视频在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 色5月婷婷丁香| 我要看日韩黄色一级片| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 三级国产精品片| 2022亚洲国产成人精品| 最近手机中文字幕大全| 国产av码专区亚洲av| 日本爱情动作片www.在线观看| 麻豆成人av视频| 七月丁香在线播放| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 在线免费十八禁| 亚洲经典国产精华液单| 搡老乐熟女国产| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 麻豆国产97在线/欧美| 尤物成人国产欧美一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99热这里只有精品一区| 久久99热这里只有精品18| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 岛国毛片在线播放| 免费观看性生交大片5| 亚洲久久久国产精品| 久久99热这里只频精品6学生| 免费大片黄手机在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 国产 一区 欧美 日韩| 国产精品国产三级专区第一集| 韩国高清视频一区二区三区| av免费观看日本| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产免费一级a男人的天堂| 五月天丁香电影| 日韩一本色道免费dvd| 热99国产精品久久久久久7| 女性生殖器流出的白浆| 日韩制服骚丝袜av| 男人爽女人下面视频在线观看| 成人免费观看视频高清| 精品久久久久久电影网| 亚洲人成网站在线播| 亚洲欧美精品自产自拍| 乱系列少妇在线播放| 日日啪夜夜撸| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲国产欧美人成| 夜夜爽夜夜爽视频| 久久久久久久久久成人| 91精品国产国语对白视频| 欧美人与善性xxx| 91久久精品国产一区二区成人| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久精品免费免费高清| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 欧美+日韩+精品| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲人成网站高清观看| 各种免费的搞黄视频| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品乱久久久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久久久久久久大av| 99热这里只有是精品在线观看| 日本午夜av视频| 久久青草综合色| 久久亚洲国产成人精品v| 丰满人妻一区二区三区视频av| 免费人成在线观看视频色| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产精品一二三区在线看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美精品一区二区大全| 亚洲va在线va天堂va国产| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品久久久精品久久久| 黄色日韩在线| av女优亚洲男人天堂| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 极品教师在线视频| 日本wwww免费看| 亚洲人成网站高清观看| 久久久久视频综合| 亚洲欧美成人精品一区二区| 高清不卡的av网站| 国产成人freesex在线| 欧美成人一区二区免费高清观看| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲av免费高清在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 2022亚洲国产成人精品| 99热全是精品| 亚洲美女视频黄频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 一级毛片aaaaaa免费看小| 免费大片18禁| 不卡视频在线观看欧美| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲国产日韩一区二区| 好男人视频免费观看在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲国产色片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 韩国高清视频一区二区三区| www.色视频.com| 秋霞伦理黄片| 男女国产视频网站| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美国产精品一级二级三级 | 97超碰精品成人国产| 午夜免费鲁丝| 亚洲成人av在线免费| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲精品国产av成人精品| 22中文网久久字幕| 欧美成人精品欧美一级黄| 日本午夜av视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久ye,这里只有精品| 亚洲精品一二三| 嫩草影院入口| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久精品夜色国产| 日韩伦理黄色片| 欧美丝袜亚洲另类| 黄片wwwwww| 少妇人妻精品综合一区二区| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产乱人偷精品视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 成年女人在线观看亚洲视频| xxx大片免费视频| 欧美人与善性xxx| 成人无遮挡网站| 国产黄片美女视频| 51国产日韩欧美| av在线蜜桃| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 在线观看三级黄色| 观看免费一级毛片| 99九九线精品视频在线观看视频| 人体艺术视频欧美日本| 嫩草影院入口| 午夜日本视频在线| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲综合色惰| 国产爽快片一区二区三区| 黑人高潮一二区| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲av成人精品一二三区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲无线观看免费| 插阴视频在线观看视频| 2022亚洲国产成人精品| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产亚洲一区二区精品| 国产成人免费观看mmmm| 熟妇人妻不卡中文字幕| 一级毛片电影观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 高清不卡的av网站| 中文字幕av成人在线电影| 国产久久久一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 欧美97在线视频| 一区二区三区四区激情视频| 日韩国内少妇激情av| 在线 av 中文字幕| 久久精品人妻少妇| av在线app专区| 日韩伦理黄色片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 男男h啪啪无遮挡| 国产男女超爽视频在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 国产成人a区在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 在线观看国产h片| 最近中文字幕2019免费版| 性色av一级| 少妇人妻 视频| 国产av一区二区精品久久 | 国产一区有黄有色的免费视频| 免费高清在线观看视频在线观看| tube8黄色片| av国产精品久久久久影院| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 在线观看免费日韩欧美大片 | 又大又黄又爽视频免费| 国产成人午夜福利电影在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 人妻一区二区av| 女性被躁到高潮视频| 亚洲av中文av极速乱| 观看免费一级毛片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 看十八女毛片水多多多| 人妻系列 视频| 亚洲精品乱久久久久久| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲欧美清纯卡通| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久久色成人| 又大又黄又爽视频免费| 综合色丁香网| 一个人看的www免费观看视频| 99久久综合免费| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲人与动物交配视频| 国产免费福利视频在线观看| 51国产日韩欧美| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 久久97久久精品| 在线看a的网站| 中文字幕免费在线视频6| 久久ye,这里只有精品| 国产成人精品福利久久| 国产精品国产三级国产专区5o| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国产欧美亚洲国产| 国产黄色视频一区二区在线观看| 视频区图区小说| 国产色爽女视频免费观看| 青春草亚洲视频在线观看| 国产成人精品久久久久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日韩制服骚丝袜av| 不卡视频在线观看欧美| 丰满人妻一区二区三区视频av| 黄色一级大片看看| 国产视频内射|