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    芒果BCH基因的克隆與表達(dá)

    2018-01-06 19:56陳景鋒趙志常高愛平黃建峰羅睿雄劉寬亮張夢云
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年22期
    關(guān)鍵詞:基因克隆芒果基因

    陳景鋒+趙志常+高愛平+黃建峰+羅睿雄+劉寬亮+張夢云

    摘要: β-胡蘿卜素羥化酶(BCH)基因是催化玉米黃素合成的關(guān)鍵基因,玉米黃素在植物光保護(hù)過程中發(fā)揮著重要的作用。采用RACE方法從黃色的金煌芒果的果皮中克隆得到了1個(gè)BCH基因,該基因全長cDNA序列為 1 160 bp,開放閱讀框?yàn)?88 bp,編碼295個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為32.97 ku,分子等電點(diǎn)為9.51。利用生物信息學(xué)在線分析軟件對(duì)其組成成分、疏水性/親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域以及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析。通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),該基因編碼的蛋白與溫州蜜柑、柚子、大豆、草莓等具有較近的親緣關(guān)系。對(duì)不同芒果品種的BCH基因的表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),紅色的貴妃品種中表達(dá)量較高,而黃色的金煌品種中表達(dá)量較低。

    關(guān)鍵詞: 芒果;β-胡蘿卜素羥化酶(BCH)基因;基因克?。换虮磉_(dá)分析;親緣關(guān)系

    中圖分類號(hào): Q785;S667.701 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2017)22-0024-03

    β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotene hydroxylase,BCH) 基因是催化玉米黃素合成的關(guān)鍵基因。目前,已經(jīng)報(bào)道了從擬南芥、甜橙、南豐蜜橘、甜椒等[1-5]植物中克隆到了該基因。由于BCH在類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵作用,已成為植物類胡蘿卜素遺傳工程改良中的主要目的基因。芒果類胡蘿卜素生物合成途徑中的 BCH基因分離和鑒定研究國內(nèi)外至今未見報(bào)道,BCH在芒果類胡蘿卜素生物合成途徑中具體作用和功能目前還不清楚。本研究中克隆并分析了芒果BCH基因,為進(jìn)一步研究BCH在芒果果實(shí)著色上的調(diào)控功能奠定分子基礎(chǔ),對(duì)揭示 BCH基因在芒果類胡蘿卜素合成及果色形成中的作用具有重要理論意義,為進(jìn)一步創(chuàng)制高胡蘿卜素含量新種質(zhì)資源、開展芒果類胡蘿卜素品質(zhì)育種提供了理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    分別用刀片切取桂七芒果完全成熟的綠果皮、金煌芒果完全成熟的黃色果皮、貴妃芒果完全成熟的紅色果皮,切碎放入采樣袋中液氮速凍后,立即放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 芒果果皮總RNA提取 采用植物RNA提取試劑盒提取芒果果皮總RNA,用DNase試劑盒進(jìn)行基因組DNA消除,RNase-free無菌水溶解,采用SMARTerTM RACE Amplification Kit(Clontech)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

    1.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 擴(kuò)增條件為:94 ℃ 4 min;94 ℃ 50 s,50 ℃ 50 s,72 ℃ 2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。 反應(yīng)體系為25 μL,其中含10×PCR buffer(含Mg2+) 2.5 μL、25 ng DNA模板、20 μmol引物、1.0 U Taq DNA聚合酶、5.0 mmol dNTPs。

    1.3 BCH基因全長cDNA序列的獲得

    以合成的 cDNA 為模板,根據(jù)已知的BCH基因片段設(shè)計(jì)cDNA 3′-RACE和5′-RACE引物,進(jìn)行3′和5′端的擴(kuò)增。將目的基因片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定及測序,并根據(jù)得到的cDNA 3′ 端和5′末端的序列結(jié)果拼接BCH的全長cDNA,設(shè)計(jì)特異引物,進(jìn)行全長cDNA序列的擴(kuò)增。

    1.4 BCH基因生物信息學(xué)分析

    根據(jù)BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)登錄的BCH蛋白序列進(jìn)行氨基酸序列的同源性分析,用DNAMAN軟件進(jìn)行序列多重比對(duì),并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹推斷其在進(jìn)化過程中親緣關(guān)系。采用bioedit軟件對(duì)BCH蛋白中各個(gè)氨基酸的含量、親水/疏水性進(jìn)行了分析。WoLFPSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)軟件進(jìn)行定位預(yù)測,采用Swissmodel(http://swissmodel.expasy.org/)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。

    1.5 表達(dá)分析

    分別提取桂七、金煌、貴妃芒果果皮的RNA,反轉(zhuǎn)為cDNA 并采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR的擴(kuò)增。RT-PCR分析采用的內(nèi)參引物序列為:actin-F,5′-AATGG AACTGGAATGGTCAAGGC-3′;actin-R,5′-TGCCAGATCT TCTCCATGTCATCCCA-3′。目的基因擴(kuò)增采用的引物為:BCH-F,5′ -CAGCATAGCCCATATAGCACTC-3′;BCH-R,5′-CAATGGAGCCGATATAAAACTAT-3′。PCR 產(chǎn)物在10%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,并采用Quantity One 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,作出相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 BCH基因的獲得

    根據(jù)得到金煌芒果BCH基因的3′端和5′端序列信息進(jìn)行拼接,最后得到BCH基因的全長cDNA序列。設(shè)計(jì)特異引物,進(jìn)行全長cDNA序列擴(kuò)增,將電泳條帶回收測序后得到BCH基因的cDNA全長序列,為1160 bp,分析發(fā)現(xiàn)開放閱讀框?yàn)?888 bp,編碼295個(gè)氨基酸序列。通過NCBI上已經(jīng)登錄的擬南芥、柚子、大豆、葡萄的BCH蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)(圖1),發(fā)現(xiàn)克隆的基因?yàn)锽CH基因。

    2.2 部分生物信息學(xué)分析

    采用bioedit軟件對(duì)芒果BCH蛋白中各個(gè)氨基酸的含量進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該蛋白丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)和纈氨酸(Val)的含量較高(圖2),用NCBI 上的CDD(conserved domain database,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)數(shù)據(jù)庫分析其氨基酸序列中可能有的蛋白功能結(jié)構(gòu)域,結(jié)果表明該蛋白有1個(gè)典型的FA-hydroxylase superfamily(脂肪酸羥化酶超家族) 保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。對(duì)其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)芒果BCH蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和β-折疊為主,也具有少量的α-螺旋結(jié)構(gòu)(圖4)。采用bioedit軟件的Kyte 和Doolittle 算法對(duì)BCH蛋白的親水性/疏水性(正值表示疏水性,負(fù)值表示親水性)進(jìn)行分析,BCH蛋白所含的氨基酸主要介于2.4~-2.3之間(圖5),采用WoLFPSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)軟件對(duì)BCH蛋白進(jìn)行定位預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該基因定位在葉綠體中,采用Swissmodel(http://swissmodel.expasy.org/)在線軟件對(duì)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,推導(dǎo)出該蛋白可能的三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)型(圖6)。采用DNAMAN軟件進(jìn)行親緣關(guān)系聚類分析發(fā)現(xiàn),芒果BCH蛋白與溫州蜜柑、柚子、大豆等植物的蛋白序列聚為一類(圖7)。endprint

    2.3 BCH基因的RT-PCR分析

    分別提取桂七、金煌、貴妃這3種不同著色品種芒果果皮的RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過上述RT-PCR分析的引物進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),該基因在紅色品種貴妃的果實(shí)中表達(dá)較多,綠色品種的桂七果皮中次之,而黃色品種的金煌果皮中相對(duì)表達(dá)較少(圖8),初步推斷BCH基因可能與紅色品種的貴妃果實(shí)中的類胡蘿卜素合成有密切的關(guān)系。

    3 討論

    BCH是玉米黃素生物合成的重要基因,基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征決定其基因的功能和性質(zhì)。通過對(duì)幾個(gè)物種的BCH蛋白的比對(duì)發(fā)現(xiàn)芒果BCH蛋白含有BCH蛋白家族相同的保守序列,即含有一個(gè)脂肪酸羥化酶超家族保守結(jié)構(gòu)域,前人通過對(duì)擬南芥、玉米、水仙等研究發(fā)現(xiàn),也含有相同的保守結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)該基因定位于葉綠體中[6],這與本研究結(jié)果相一致。通過聚類分析表明,芒果BCH基因與柑橘類具有較近的親緣關(guān)系。對(duì)其表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),紅色的貴妃品種中表達(dá)量較高, 而黃色的金煌品種中表達(dá)量較低。孫化雨等對(duì)毛竹的根、幼莖、葉片、葉鞘、節(jié)等部分的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),BCH基因主要在葉片中表達(dá),而根中表達(dá)量較少[7];對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥分析發(fā)現(xiàn),葉片中葉綠素、葉黃素、類胡蘿卜素等含量升高,表明在毛竹中BCH基因的過量表達(dá)促進(jìn)了類胡蘿卜素向玉米黃素轉(zhuǎn)化,使其含量增加,抗脅迫能力增加[8-9]。本研究從金煌芒果果皮中克隆得到了1個(gè)BCH基因,對(duì)該基因在芒果中的功能研究還須要進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證其功能及在對(duì)芒果果實(shí)色澤形成的作用機(jī)理,為深入理解芒果果實(shí)色澤形成多樣性的原因提供理論依據(jù),并為生產(chǎn)中著色不良成因提供改善的技術(shù)支持。

    [HS2][HT8.5H]參考文獻(xiàn):

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