氣相色譜法測(cè)定飼料中BHT和EQ兩種抗氧化添加劑

上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所 董茂鋒 白 冰 饒欽雄 宋衛(wèi)國 楊海鋒 趙志輝

2，6-二叔丁基對(duì)甲酚 （BHT）和乙氧基喹啉（EQ）是目前應(yīng)用最廣泛的兩種通用型酚類抗氧化劑（熊中強(qiáng)等，2011）。作為飼料添加劑，其對(duì)于改善飼料的品質(zhì)，防止飼料中維生素等營養(yǎng)成分的氧化變質(zhì)有重要的作用。由于BHT和EQ組成的抗氧化飼料添加劑具有高濃度含量的特點(diǎn)以及復(fù)雜的飼料基質(zhì)，從而使在檢測(cè)過程中按照一般的殘留分析方法不能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的含量測(cè)定。近幾年來，對(duì)于抗氧化劑的測(cè)定，主要有氣相色譜法和液相色譜法（楊曉鳳，2011；李秀勇等，2008；穆同娜等，2008；郭嵐等，2007；胡小鐘等，2000）。 但是對(duì)于添加劑中的BHT和EQ分析報(bào)道較少，本研究以廣泛的應(yīng)用性和分析準(zhǔn)確性為基礎(chǔ)，通過目前應(yīng)用廣泛的前處理方式，以及對(duì)前處理過程中的條件優(yōu)化，建立了氣相色譜法測(cè)定飼料中兩種抗氧化添加劑BHT和EQ含量的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 BHT和EQ標(biāo)準(zhǔn)品 （純度≥98%，購于SIGMA），用異丙醇溶解配制為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，從中分別取一定量的貯備液用異丙醇稀釋成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，2～8℃下保存1個(gè)月；異丙醇、甲醇、乙腈和丙酮為分析純。超聲儀。

1.2 色譜條件 色譜柱：DB-17ms柱，30.0 m×0.32 mm × 0.25 μm；載氣：N2；流速：2.0 mL/min；升溫程序：100℃保持1 min，然后以15℃/min速度升至210℃，再以40℃/min速度升至260℃保持1.5 min；進(jìn)樣口溫度：230℃；檢測(cè)器溫度：300℃；空氣流量：380 mL/min；氫氣流量：40 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。

1.3 樣品的制備提取 稱取1.0 g試樣置入150 mL棕色容量瓶中，加入100 mL異丙醇，置于超聲儀中超聲提取4 h，取上清液 （樣品提取液）2 mL，過 0.22 μm 濾膜，裝入進(jìn)樣小瓶，待測(cè)；若樣品中BHT和EQ的含量過高，超出線性范圍，則取上清液1 mL，用異丙醇稀釋，過0.22 μm濾膜，裝入進(jìn)樣小瓶，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢出限和線性范圍 從測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液（S/N＜20的濃度）所得到色譜圖中，以3倍信噪比（S/N＝3）為檢測(cè)限（LOD），以 10 倍信噪比（S/N≥10）為定量限（LOQ），計(jì)算所得BHT和EQ的檢出限分別為0.015%和0.020%，定量限分別為0.045%和0.06%。

用異丙醇配制一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，BHT和EQ 的濃度分別為 900、600、400、200、100、50、25 mg/L 和 900、600、300、150、75、37.5 mg/L，濃度由低至高進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積和質(zhì)量濃度計(jì)算。BHT和EQ的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程見圖1。

2.2 樣品提取溶劑和提取時(shí)間的選擇 溶劑作為影響提取樣本中目標(biāo)化合物的最重要因素，本試驗(yàn)選取了極性差別較大的5種常規(guī)溶劑作為考察對(duì)象。稱取混合均勻的飼料抗氧化添加劑0.5 g，分別加入100 mL異丙醇、甲醇、乙腈、丙酮和正己烷5種溶劑，比較BHT和EQ在不同溶劑中提取效果。由于抗氧化添加劑中BHT和EQ的含量比較高，且目標(biāo)化合物容易被空氣氧化，因此提取時(shí)間的長(zhǎng)短是影響提取效果的重要因素。

由圖2可見，5種溶劑對(duì)BHT和EQ均有一定的提取效果，且在提取4 h后，BHT和EQ的含量不再有較大的變化，但是異丙醇的提取效果最佳。選取異丙醇為提取溶劑時(shí)，BHT和EQ的提取含量最高，分別為3.62%和14.00%，而正己烷對(duì)BHT的提取效果最差為3.07%，乙腈對(duì)EQ的提取效果最差為12.46%。

2.3 提取溶劑體積的優(yōu)化 除溶劑種類和提取時(shí)間外，提取溶劑的體積量也是前處理過程中影響B(tài)HT和EQ提取效果的主要因素之一。根據(jù)2.1中的結(jié)果，選用異丙醇為提取溶劑，提取時(shí)間為4 h，考察提取不同提取溶劑體積和稱樣質(zhì)量比例對(duì)BHT和EQ的提取效果的影響，結(jié)果見圖3。

保持樣品稱樣量不變，改變異丙醇的體積，4 h超聲提取后，觀察不同異丙醇體積提取的樣品中BHT和EQ的含量。實(shí)驗(yàn)選取了4個(gè)考察點(diǎn)，異丙醇和樣品質(zhì)量的比分別是100，140，200 mL/g和400 mL/g。由圖3可見，樣本中BHT和EQ的含量在4個(gè)不同體積和樣品量的實(shí)驗(yàn)設(shè)定中，BHT的含量變化范圍為3.10%～3.35%，相對(duì)偏差為3.55%，而EQ的含量變化范圍為14.53%～15.04%，相對(duì)偏差為1.45%，相對(duì)偏差均小于5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)異丙醇提取體積與稱樣量的比例在100～400 mL/g的范圍內(nèi)，增加異丙醇的提取體積，BHT和EQ的含量無明顯提升，說明對(duì)于1.0 g樣品中的BHT和EQ，100 mL異丙醇可完全提取出全部的BHT和EQ。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精確度測(cè)定 通過上述的前處理提取的優(yōu)化，確立了1.0 g樣品添加100 mL異丙醇超聲提取4 h的前處理方法，實(shí)驗(yàn)通過3個(gè)不同濃度的添加水平以及3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和精確度，檢測(cè)結(jié)果見表1。由表1可見，方法的回收率為77.89%～90.53%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.27%～8.35%。

2.5 BHT和EQ在空氣中的氧化速度測(cè)定BHT和EQ的主要作用是防止添加對(duì)象中某些易被氧化的物質(zhì)被氧化，從而延長(zhǎng)添加對(duì)象的保質(zhì)期。因此BHT和EQ在接觸空氣過程中，其被氧化的能力和速度成為其作為抗氧化劑的一個(gè)重要指標(biāo)。稱取50.0 g含有一定質(zhì)量的BHT和EQ樣本放置在表面皿中，放于常溫實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，觀察其在50 d內(nèi)BHT和EQ的氧化情況。隔一定時(shí)間稱取混合均勻的樣品按照已經(jīng)建立的抗氧化劑中BHT和EQ的檢測(cè)方法測(cè)定BHE和EQ的含量，結(jié)果見圖4。

表1 飼料添加劑中的BHT和EQ的添加回收率測(cè)定結(jié)果%

由圖4可見，在50 d內(nèi)，BHT的含量從3.62%降到0.052%，而EQ的含量則從14%降到6.27%。在前7 d，BHT和EQ的氧化速度最快，分別從3.62%和14%降到1.03%和7.4%；在第7天到第28天內(nèi)，BHT的氧化效果明顯，從1.03%氧化到0.29%，而EQ的氧化效果不明顯，保持在7.23%～7.4%范圍內(nèi)；第28天到第50天，BHT氧化率為0.08%，而EQ首先在第28天從7.3%快速被氧化到第40天的6.36%后，從第40天到第50天未出現(xiàn)明顯氧化現(xiàn)象。結(jié)果表明，BHT和EQ在最初的7 d內(nèi)被氧化的速度最快，而BHT的被氧化能力明顯高于EQ的被氧化能力，在BHT存在的前提下，EQ能夠在7～28 d和40～50 d的兩個(gè)階段保持含量未發(fā)生明顯變化。

3 結(jié)論

通過對(duì)不同提取溶劑、提取時(shí)間以及提取溶劑量三方面的考察，建立了合理簡(jiǎn)單符合分析化學(xué)要求的通過異丙醇超聲提取4 h采用GC-FID測(cè)定飼料中BHT和EQ含量的分析方法，為抗氧化劑中的BHT和EQ的含量測(cè)定提供檢測(cè)分析方法。該方法BHT和EQ方法檢出限分別為0.015%和0.02%，添加回收率為77.89%～90.53%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.27%～8.35%。實(shí)驗(yàn)考察了BHT和EQ在空氣中的被氧化能力，并總結(jié)出在暴露空氣室溫條件下，BHT和EQ的氧化規(guī)律，為相關(guān)的BHT和EQ的作為抗氧化劑使用提供參考。

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