子宮內(nèi)膜癌組織中Elf5的表達(dá)變化及意義

楊荷，閆洪超

(1徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，江蘇徐州221004;2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

子宮內(nèi)膜癌組織中Elf5的表達(dá)變化及意義

楊荷1，閆洪超2

(1徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，江蘇徐州221004;2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的探討Elf5在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法選取子宮內(nèi)膜癌組織84例份、子宮內(nèi)膜不典型增生組織30例份和正常子宮內(nèi)膜組織30例份,用免疫組化法檢測(cè)Elf5在不同內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況，分析其與子宮內(nèi)膜癌患者各臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性；對(duì)所有子宮內(nèi)膜癌患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，采用Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行子宮內(nèi)膜癌多因素分析。結(jié)果①子宮內(nèi)膜癌組織Elf5陽性表達(dá)率低于正常子宮內(nèi)膜組織及不典型增生子宮內(nèi)膜組織(χ2分別為5.787、1.614，P均<0.05)；②Elf5的表達(dá)與FIGO分期、病理分級(jí)、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肌層浸潤(rùn)深度有關(guān)(P均<0.05)；③Kaplan-Meier生存分析顯示，Elf5陰性表達(dá)患者的平均生存時(shí)間短于陽性表達(dá)患者(P<0.05)；④Cox回歸分析顯示FIGO分期、病理分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Elf5與子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后有關(guān)(P均<0.05)，其中 Elf5是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。結(jié)論子宮內(nèi)膜癌組織中 Elf5表達(dá)降低，其水平降低與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。

子宮內(nèi)膜癌；抑癌基因；Elf5基因

子宮內(nèi)膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示有1.6%的子宮內(nèi)膜癌患者年齡在20～34歲，6.1%在35～44歲[1]。雖然早期子宮內(nèi)膜癌接受手術(shù)治療和輔助治療后有較好的預(yù)后,但由于缺乏有效的早期診斷方法,許多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)。多種因素影響著子宮內(nèi)膜癌的治療效果,如臨床因素(手術(shù)-病理分期、肌層浸潤(rùn)深度、輔助治療等)以及生物因素(類固醇受體、生長(zhǎng)因子、癌基因、抑癌基因等)[2]。近年來篩查子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)指標(biāo)及基因治療逐漸成為研究熱點(diǎn)。Elf5又稱ESE2，屬于能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化凋亡的Ets轉(zhuǎn)錄因子家族，具有上皮特異性，在胎盤、肺支氣管、乳腺中起到重要調(diào)節(jié)作用[3～5]。Chakrabarti等[6]研究表明，在正常乳腺中，Elf5有潛在的抑癌基因作用。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),卵巢上皮癌組織中Elf5 mRNA表達(dá)降低，其缺失影響卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展[7～9]。然而在與乳腺癌、卵巢癌相類似都存在一定程度激素依賴性的子宮內(nèi)膜癌中Elf5的作用卻未得到充分揭示，本研究旨在探討Elf5在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床意義，為子宮內(nèi)膜癌的診斷治療及評(píng)估預(yù)后提供新的靶點(diǎn)和思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 標(biāo)本均來自2010年1月～2014年12月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦科行手術(shù)治療的患者在病理科存檔的組織蠟塊。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，均取得患者知情同意。標(biāo)本中子宮內(nèi)膜癌組織84例份(內(nèi)膜癌組),患者年齡38～70歲、平均54.61歲。其中手術(shù)-病理分期(FIGO，2009)：Ⅰ期 54例，Ⅱ期10例，Ⅲ+Ⅳ期20例；肌層浸潤(rùn)深度：≤1/2 52例, >1/2 32例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有 41例，無 26例(共67例行淋巴清掃術(shù))；病理類型：子宮內(nèi)膜樣腺癌 68例；非子宮內(nèi)膜樣腺癌16例；子宮內(nèi)膜腺癌病理分級(jí)：G1級(jí)50例，G2級(jí)8例，G3級(jí)10例；月經(jīng)：有 15例，無 69例。納入標(biāo)準(zhǔn)：子宮內(nèi)膜癌患者臨床、病理資料完整，均進(jìn)行術(shù)后隨訪，主要包括門診、電話隨訪?；颊呓邮苁中g(shù)的日期為隨訪起點(diǎn)，2017年6月31日為隨訪截止日期。排除標(biāo)準(zhǔn)：除外合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤、來自于生殖系統(tǒng)其他器官腫瘤的轉(zhuǎn)移癌(包括原發(fā)性雙癌)及首次治療為化療、放療或內(nèi)分泌治療。選取同期存檔的因功血行手術(shù)治療且經(jīng)病理證實(shí)為不典型增生的子宮內(nèi)膜組織蠟塊標(biāo)本30例份(不典型增生組)，患者年齡40～74歲、平均45.93歲。選取同期存檔的因子宮肌瘤行手術(shù)治療后經(jīng)病理證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜組織的蠟塊標(biāo)本30例份(正常組)，患者年齡37～51歲、平均49.73歲。

1.2 組織中Elf5蛋白表達(dá)的檢測(cè) 按照試驗(yàn)分組，所有標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片?？酒蠼攵妆?、梯度乙醇脫蠟至水。3% H2O2室溫孵育10 min，檸檬酸高壓抗原修復(fù)。滴加Elf5抗體，4 ℃孵育過夜，加入超敏兔兩分法檢測(cè)試劑盒，37 ℃孵育30 min， DAB顯色。復(fù)染、常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。Elf5抗體(bs-14564R )購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，超敏兔兩分法檢測(cè)試劑盒(PV-9001)及DAB試劑盒(ZLI9018)購(gòu)自北京中衫金橋公司。 由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的副高職稱醫(yī)師分別閱片。采用半定量法，隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)高倍視野觀察100個(gè)細(xì)胞，按每個(gè)高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)數(shù)：陽性細(xì)胞<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。胞核按著色強(qiáng)弱計(jì)分:無著色0分，淡黃色1分,黃色2分，棕黃色3分。兩種計(jì)分方法的乘積作為總評(píng)分：0分計(jì)為陰性，1～4分計(jì)為弱陽性(+)，5～8分計(jì)為中等強(qiáng)度陽性(++)，9分以上計(jì)為強(qiáng)陽性(+++)。+～+++均計(jì)為陽性?？傟栃月?(弱陽性+中度強(qiáng)度陽性+強(qiáng)陽性例數(shù))/總例數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。Elf5在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或Fisher′s確切概率法；應(yīng)用Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析；應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)生存率組間差異性；應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析進(jìn)行單因素、多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同子宮內(nèi)膜組織中Elf5的表達(dá)比較 Elf5主要在細(xì)胞核中表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)也有少量表達(dá)，呈棕黃色顆粒。在正常組、不典型增生組、內(nèi)膜癌組中，Elf5陽性表達(dá)率分別為93.33%(28/30)、 83.33%(25/30)、 69.05%(58/84)。內(nèi)膜癌組Elf5陽性表達(dá)率低于正常組及不典型增生組(χ2分別為5.787、1.614，P均<0.05)。

2.2 子宮內(nèi)膜癌組織中Elf5表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Elf5表達(dá)與FIGO分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)、病理類型有關(guān)(χ2分別為47.757、25.831、25.831、51.414、11.118，P均<0.05)。見表1。

2.3 Elf5表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的關(guān)系 84例子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，隨訪時(shí)間6～67個(gè)月，失訪18例，死亡11例，隨訪率78.57%。Elf5陰性表達(dá)患者平均生存期 66.766個(gè)月，Elf5陽性表達(dá)患者平均生存期42.842個(gè)月。Elf5陽性表達(dá)患者總生存期長(zhǎng)(χ2=8.508，P=0.004)，見圖1。

表1 子宮內(nèi)膜癌組織中Elf5表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：*84例子宮內(nèi)膜癌患者中共67例行淋巴結(jié)活檢或清掃術(shù);*68例子宮內(nèi)膜腺癌患者行病理分級(jí)。

圖1 Elf5陽性和陰性子宮內(nèi)膜癌患者生存曲線

2.4 子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后相關(guān)因素 Cox單因素分析顯示：年齡(χ2=0.190，P=0.663)、病理類型(χ2=0.870，P=0.351)、月經(jīng)有無(χ2=0.001，P=0.975)與預(yù)后無關(guān)，而FIGO分期(χ2=6.619，P=0.010)、肌層浸潤(rùn)深度(χ2=4.337，P=0.037)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=4.788，P=0.029)、病理分級(jí)(χ2=4.225，P=0.040)、Elf5(χ2=6.706，P=0.010)與預(yù)后相關(guān)。Cox多因素分析顯示：將FIGO分期、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)及Elf5納入Cox模型進(jìn)行多因素分析，最終篩選結(jié)果顯示Elf5是影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素(χ2=4.424，P=0.035，HR=0.226，95%CI：0.056～0.904)。

3 討論

Elf5是Ets轉(zhuǎn)錄家族成員之一，Ets家族在細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖及凋亡等活動(dòng)中起到非常重要的調(diào)節(jié)作用。Elf5位于人11號(hào)染色體短臂13～15區(qū)，具有上皮特異性，在胎盤、肺支氣管、乳腺、腎等器官中均有表達(dá)[3]。Lee等[3]在人類乳腺癌組織和細(xì)胞系中觀察到Elf5表達(dá)缺失。Yan等[7]研究表明，Elf5 mRNA在卵巢上皮性癌及交界性卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)均明顯低于良性卵巢上皮性腫瘤及正常卵巢組織,從而推測(cè)其可能為一個(gè)潛在的抑癌基因。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織中Elf5陽性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示Elf5表達(dá)減少或缺失有可能促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生,子宮內(nèi)膜癌中Elf5可能發(fā)揮抑癌作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織Elf5陽性表達(dá)率隨著FIGO分期、病理分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度增加以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)展呈下降趨勢(shì)，而與年齡、是否絕經(jīng)無關(guān)。由此表明Elf5表達(dá)的變化可能與腫瘤發(fā)展相關(guān)。Colas等[10]研究表明，子宮內(nèi)膜癌發(fā)生肌層浸潤(rùn)的前提是上皮性腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷不同程度的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。EMT能通過改變上皮細(xì)胞向間充質(zhì)/干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的狀態(tài)從而影響細(xì)胞黏附、細(xì)胞極性和細(xì)胞遷移。Zhou等[11]的研究表明，在腫瘤細(xì)胞中EMT及其逆向程序被激活，使腫瘤細(xì)胞能夠獲得更高級(jí)別的侵襲性以及復(fù)發(fā)有關(guān)的細(xì)胞特征。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Elf5可能通過抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)來抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移[8]。Elf5在子宮內(nèi)膜癌中可能具有相同的作用，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

Elf5表達(dá)與激素有密切關(guān)系。在乳腺中催乳素和孕酮能夠促進(jìn)Elf5表達(dá)，在懷孕期間促進(jìn)胚前體細(xì)胞發(fā)育成雌激素受體α和孕激素受體，從而減少乳汁分泌。Ⅰ型內(nèi)膜癌即雌激素依賴型內(nèi)膜癌，均為子宮內(nèi)膜樣腺癌，其發(fā)生與無孕激素對(duì)抗的條件下雌激素長(zhǎng)期作用有關(guān)。多數(shù)研究報(bào)告顯示雌激素受體α從正常子宮內(nèi)膜組織到G1～G3級(jí)表達(dá)逐漸減少，雌激素受體β(ERβ)在絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜和G3級(jí)的內(nèi)膜癌的胞質(zhì)中顯著表達(dá)，ERβ可能參與雌激素的非基因組效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜樣腺癌中Elf5陽性表達(dá)率高于其他病理類型(如漿液性癌、鱗狀細(xì)胞癌等)。

子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后相關(guān)的影響因素較多，無一致結(jié)論。張英蘭等[12]采用單因素生存分析顯示，年齡、絕經(jīng)、陰道出血、病理類型、組織學(xué)分級(jí)、手術(shù)病理分期、肌層浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹腔細(xì)胞學(xué)陽性及術(shù)后輔助治療對(duì)子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后有影響。本研究結(jié)果顯示,手術(shù)病理分期、病理分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Elf5是子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的影響因素，Elf5為影響子宮內(nèi)膜癌的獨(dú)立因素。提示Elf5可能可作為一種理想的判斷子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。

[1] Stewart CJ, Doherty DA, Havlat M, et al. Trans tubal spread of endometrial carcinoma: correlation of intra-luminal tumor cells with tumor grades, peritoneal fluid cytology and extra-uterine metastasis[J]. Pathology, 2013,45(4):382-387.

[2] Xu Z， Peng ZL， Zeng LQ， et al． Clinical pathologic features and risk factors for pelvic lymph node metastasis in uterine endometrioid cancer： 358 cases report [J]. Chin J 0bstetrics & Gynecology Pediatrics， 2014，10(2)：165-169．

[3] Lee HJ， Ormandy CJ. Elf5, hormones and cell fate[J]. Trends Endocrinology Metab, 2012,23(6):292-298.

[4] Kalyuga M, Gallego-Ortega D, Lee HJ, et al. ELF5 suppresses estrogen sensitivity and underpins the acquisition of antiestrogen resistance in luminalbreast cancer[J]. PLoS Biology, 2012,10(12):252-253.

[5] Pearton DJ, Smith CS, Redgate E, et al. Elf5 counteracts precocious trophoblast differentiation by maintaining Sox2 and 3 and inhibiting Hand1 expression[J]. Dev Biol, 2014，392(2):344-357.

[6] Chakrabarti R, Wei Y, Romano RA, et al. Elf5 regulates mammary gland stem progenitor cell fate by influencing notch signaling[J]. Stem Cells, 2012,30(7):1496-1508.

[7] Yan H, Qiu L, Xie X, et al. ELF5 in epithelial ovarian carcinoma tissues and biological behavior in ovarian carcinoma cells[J]. Oncol Rep, 2017,37(3):1412-1418.

[8] 邱玲琳，閆洪超.ELF5基因?qū)θ寺殉舶┘?xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和大鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)制[J].山東醫(yī)藥，2017,57(13):45-48.

[9] 謝肖磊，閆洪超.轉(zhuǎn)染ELF5基因的人卵巢癌干細(xì)胞增殖、周期、凋亡及成瘤能力變化 [J].山東醫(yī)藥，2017,57(3):32-35.

[10] Colas E, Pedrola N, Devis L, et al. The EMT signaling pathways in endometrial carcinoma[J]. Clin Transl Oncol, 2012,14(10):715-720.

[11] Zhou ZJ, Dai Z, Zhou SL, et al. HNRNPAB induces epithelial-mesenchymal transition and promotes metastasis of hepatocellular carcinoma by transcriptionally activating Snail [J]. Cancer Res, 2011,74(10):2750-2762.

[12] 張英蘭，呂昌帥，郎景和.225例子宮內(nèi)膜癌患者生存預(yù)后相關(guān)因素的分析[J].國(guó)際生殖健康與計(jì)劃生育雜志，2016，35(2):109-112.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.023

R711.7

B

1002-266X(2017)45-0071-03

閆洪超(E-mail:1015058194@qq.com)

2017-09-19)