新鑒定高抗TMV普通煙草枯斑資源的N導(dǎo)入片段長度多樣性

劉勇，李梅云，于海芹，黃昌軍，李永平

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家煙草基因工程研究中心 昆明，650021

煙草花葉病毒?。═MV）是我國煙草的重要病害，每年造成的損失位列十大煙草侵染性病害名單前列[1-2]。種植抗病品種是防控TMV最根本和最經(jīng)濟(jì)有效的手段，我國已經(jīng)選育10多個(gè)高抗TMV的常規(guī)品種[3-4]和雜種1代品種[5-9]，但這些高抗TMV品種的推廣面積不大。優(yōu)良抗源是選育高抗且豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種的關(guān)鍵之一?？緹熎贩NTMV抗性主要來源于煙草野生種心葉煙（Nicotiana glutiosa），其抗性由一個(gè)顯性單基因（N）控制[10]。通過一系列的常規(guī)雜交和回交轉(zhuǎn)育，N基因抗性從心葉煙轉(zhuǎn)育至香料煙中，然后轉(zhuǎn)育至白肋煙和烤煙品種中[11-14]。常規(guī)雜交和回交轉(zhuǎn)育的是攜帶N基因的心葉煙染色體片段，簡稱N導(dǎo)入片段。N導(dǎo)入片段上與N基因緊密連鎖的心葉煙基因在烤煙品種中導(dǎo)致連鎖累贅，表現(xiàn)為產(chǎn)量較低、初烤煙葉外觀質(zhì)量稍差[15-17]。N導(dǎo)入片段較短的資源，推測其連鎖累贅可能較小，育種利用潛力較大。

目前我國用于選育抗TMV烤煙品種的抗病親本數(shù)量少，主要有9501、8022、Coker176、Ky56、Coker86、CV58、CV87、KX13等[6-8,18]。我國收集保存了4000多份煙草種質(zhì)資源，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，至2016年對(duì)約2000份種質(zhì)資源（包含重復(fù)鑒定資源）開展過TMV抗性鑒定[19-28]，2016年云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院采用人工接種鑒定出94份國外新引的高抗TMV的種質(zhì)資源，其中大部分屬于接種TMV表現(xiàn)枯斑的普通煙草（簡稱普通煙草枯斑資源）[28]。普通煙草資源包括烤煙、白肋煙、香料煙、曬煙、雪茄煙，不包括黃花煙、野生煙和種間雜交種。這些新鑒定高抗TMV抗源的育種利用，需要明確是否攜帶N基因以及N導(dǎo)入片段長度。劉勇等基于番茄的基因組物理圖譜開發(fā)了定位N導(dǎo)入片段的分子標(biāo)記[29]。本文利用分子標(biāo)記對(duì)63份普通煙草枯斑資源的N導(dǎo)入片段長度進(jìn)行了鑒定，可為抗TMV種質(zhì)資源的育種利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

普通煙草枯斑資源63份（表1），來源于云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院2016年新鑒定出高抗TMV的煙草資源[27-28]。每份資源挑選3株采集幼葉，-80℃保存，分別用于提取DNA。以N基因陰性的K326為N導(dǎo)入片段陰性對(duì)照。

1.2 DNA提取

采用QIAGEN DNeasy Plant Mini試劑盒提取煙草總基因組DNA。采用紫外分光光度法（Nanodrop）和瓊脂糖凝膠電泳法初步檢測DNA質(zhì)量。質(zhì)量合格的DNA樣品，用0.5×TE溶液稀釋至30～50 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分子標(biāo)記檢測與N導(dǎo)入片段大小估算

分子標(biāo)記檢測：PCR 反應(yīng)體系總體積均為20 μL，其中30～50 ng/μL DNA 樣品2.5 μL、10×PCR buffer 2.0 μL，dNTPs 1.2 μL，分子標(biāo)記引物各1.5 μL，rTaq 酶0.3 μL，ddH2O 11.0 μL。所用試劑購自寶生物公司。PCR反應(yīng)在Eppendorf梯度擴(kuò)增儀上（Master Cycler）上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存；采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。

首先采用N基因的特異分子標(biāo)記N1N2鑒定出攜帶N基因的普通煙草資源[30]。然后采用N導(dǎo)入片段的分子標(biāo)記（GL3.50，GL4.06，N1N2，TN5.226，TN5.51）檢測N導(dǎo)入片段的長度[29]。N1N2標(biāo)記對(duì)應(yīng)于番茄11號(hào)染色體4.39Mb處的N基因同源體，在估算N導(dǎo)入片段長度時(shí)，本文以TN4.39表示。根據(jù)N導(dǎo)入片段特異分子標(biāo)記檢測結(jié)果（陰性或陽性），判斷N導(dǎo)入片段缺失或者攜帶該標(biāo)記對(duì)應(yīng)的DNA片段。利用N導(dǎo)入片段的左右末端鄰近的兩個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果估算導(dǎo)入片段長度。若距離N基因近的一側(cè)標(biāo)記為陽性，距離N基因遠(yuǎn)的一側(cè)標(biāo)記檢測為陰性，表明該資源的N導(dǎo)入片段末端位于這兩個(gè)標(biāo)記之間。由于N導(dǎo)入片段的基因組尚未組裝為可計(jì)算物理距離的染色體，煙草N導(dǎo)入片段的長度用其左右末端陽性標(biāo)記對(duì)應(yīng)番茄11號(hào)染色體的物理距離表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通煙草中N導(dǎo)入片段長度的類型

對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的普通煙草枯斑資源，首先采用N基因特異分子標(biāo)記篩選出攜帶N基因的資源，然后檢測N導(dǎo)入片段的長度。根據(jù)N基因和N導(dǎo)入片段的分子標(biāo)記的檢測結(jié)果，供試的63份普通煙草枯斑資源可劃分為3大類型，以最常見的代表種質(zhì)命名為：Coker176類型：GL3.50和GL4.06檢測陰性、TN4.39、TN5.226、TN5.51檢測陽性；Samsun NN類型：GL3.50、 GL4.06、TN4.39、TN5.226檢測陽性，TN5.51檢測陰性；Xanthi nc 類型：GL3.50、GL4.06、TN4.39、TN5.226、TN5.51檢測陽性，其中TN5.77為普通煙草的標(biāo)記，TN5.77檢測陽性表明N導(dǎo)入片段對(duì)應(yīng)的標(biāo)記為陰性（圖1，圖2）。

圖1 3種類型資源的N導(dǎo)入片段分子標(biāo)記檢測Fig.1 Three types of germplasms tested by molecular marker of N introgression segment

圖2 3種N導(dǎo)入片段長度類型示意圖Fig.2 Diagram of three length types of N introgression segment

2.2 普通煙草枯斑資源的N導(dǎo)入片段長度多樣性

N導(dǎo)入片段的長度用其左右末端陽性標(biāo)記的基因組物理距離表示。63份普通煙草枯斑資源采用N基因分子標(biāo)記N1N2檢測都為陽性， 5個(gè)N導(dǎo)入片段特異的分子標(biāo)記檢測結(jié)果表明（表1）：402等51份資源的N導(dǎo)入片段長度屬于Coker176類型，為GL4.06陰性、TN4.39、TN5.51和TN5.77陽性。GL4.06標(biāo)記和TN4.39標(biāo)記在番茄11號(hào)染色體上為位置分別為4.06 Mb和4.39 Mb，TN5.51標(biāo)記和TN5.77標(biāo)記在番茄11號(hào)染色體上為位置分別為5.51 Mb和5.77 Mb。TN4.39與TN5.51標(biāo)記對(duì)應(yīng)于番茄染色體的物理距離為1.12 Mb， GL4.06和TN5.77對(duì)應(yīng)于番茄染色體的物理距離為1.71 Mb。因此，Coker176的N導(dǎo)入片段的相對(duì)長度范圍為1.12 Mb～1.71 Mb（參比番茄11號(hào)染色體，圖2）。

Ky160等2份資源的N導(dǎo)入片段長度屬于Samsun NN類型，GL3.50標(biāo)記和TN5.226標(biāo)記檢測為陽性，TN5.51標(biāo)記為陰性。GL3.50標(biāo)記和TN5.226標(biāo)記在番茄11號(hào)染色體上為位置分別為3.50 Mb和5.226 Mb，二者的物理距離為1.726 Mb，因此Samsun NN的N導(dǎo)入片段相對(duì)長度為大于1.726 Mb小于2.01 Mb（參比番茄11號(hào)染色體，圖2）。

Ky52等10份資源的N導(dǎo)入片段長度屬于Xanthi nc類型。Xanthi nc和Xanthi-parental的N導(dǎo)入片段較長，GL3.50標(biāo)記和TN5.51標(biāo)記檢測Xanthi nc為陽性，GL3.50標(biāo)記和TN5.51標(biāo)記在番茄11號(hào)染色體上為位置分別為3.50 Mb和5.51 Mb，二者的物理距離為2.01 Mb，因此Xanthi nc的N導(dǎo)入片段相對(duì)長度為大于2.01 Mb（參比番茄11號(hào)染色體，圖2）。

表1 部分枯斑資源的N導(dǎo)入片段長度多樣性Tab.1 N introgression segment length polymorphism of local germplasms

3 討論與結(jié)論

本文將30℃條件下接種TMV表現(xiàn)為枯斑的普通煙草資源簡稱為“普通煙草枯斑資源”。我國利用人工接種鑒定出的高抗TMV種質(zhì)資源分布于整個(gè)煙草屬(Nicotiana)[19-28]。煙草屬種質(zhì)資源包括普通煙草（N.tabacum）、黃花煙（N.rustica）、野生種和種間雜交種。根據(jù)調(diào)制模式和工業(yè)用途不同，普通煙草又分為烤煙、白肋煙、曬煙和雪茄煙等類型。由于種間生殖隔離，黃花煙和野生種的TMV抗源難以應(yīng)用于普通煙草育種，黃花煙和部分野生種的TMV抗性與N導(dǎo)入片段無關(guān)。因此，本文重點(diǎn)鑒定普通煙草枯斑資源的N導(dǎo)入片段長度。

目前，菲利普·莫里斯公司公開了包含N導(dǎo)入片段的TN90的基因組草圖數(shù)據(jù)[31]，由于尚未組裝為可計(jì)算物理距離的染色體，利用N基因序列只能調(diào)取到大小為40.5 Kb的一個(gè)Scaffold（未列出數(shù)據(jù)）。而和煙草同屬于茄科的番茄公開了染色體基因組數(shù)據(jù)[32]，該番茄基因組11號(hào)染色體包含N基因的同源體，番茄11號(hào)染色體上N基因同源體兩側(cè)的基因具有明確的物理距離。本文N導(dǎo)入片段特異分子標(biāo)記是根據(jù)番茄11號(hào)染色體上N基因同源體兩側(cè)的共線性基因開發(fā)的，標(biāo)記名稱中的數(shù)字對(duì)應(yīng)于番茄11號(hào)染色體上的物理距離。因此，煙草N導(dǎo)入片段的相對(duì)長度以參比番茄11號(hào)染色體上標(biāo)記間的物理距離表示。番茄的基因組大小為0.8 Gb[32]，二倍體煙草祖先種的基因組大小約為2.5 Gb[31]。煙草二倍體祖先種基因組大小為番茄的3倍左右，煙草N導(dǎo)入片段的長度可按照番茄物理距離的3倍粗略估算。

本文鑒定的51份屬于Coker176類型的大部分資源為烤煙、白肋煙和雪茄煙，10份屬于Xanthi nc 類型的大部分資源為香料煙，只有2份資源屬于Samsun NN類型。N導(dǎo)入片段的長度多樣性分布與普通煙草抗TMV育種歷史吻合。Holmes首先將心葉煙的整條H染色體轉(zhuǎn)育至香料煙Samsoun中[10]。整條心葉煙H染色體導(dǎo)入普通煙草中帶來較大的連鎖累贅。育種研究人員通過多次回交選擇，逐漸將心葉煙H染色體片段縮短，逐漸將較短的N導(dǎo)入片段在烤煙和白肋煙中育種利用。因此，在較古老的香料煙種質(zhì)資源中保留了較長的N導(dǎo)入片段，而烤煙和白肋煙資源中的N導(dǎo)入片段較短。較早選育的一個(gè)抗TMV烤煙品種為1949年登記的Vamorr 48, Vamorr 48的N導(dǎo)入片段屬于較短的Coker176類型。從1949年登記的Vamorr 48至最近選育的烤煙和白肋煙品種的N導(dǎo)入片段都屬于Coker176類型[33]，可見，在選育出Vamorr 48之后的近65年中，育種研究人員選育了大量抗TMV品種，但未能將Coker176類型的N導(dǎo)入片段縮短?？赡茉蛴袃牲c(diǎn)，一是N導(dǎo)入片段與普通煙草的對(duì)應(yīng)染色體的同源性較低，減數(shù)分裂時(shí)不容易發(fā)生交換，因此，育種過程中發(fā)生染色體交換的頻率很低[30]。二是烤煙中Coker176類型的N導(dǎo)入片段的連鎖累贅表型在田間表現(xiàn)為產(chǎn)量稍低、新鮮葉片外觀相對(duì)平滑僵硬（木質(zhì)化woody）[15-16]，累贅表型容易受氮肥、土壤等環(huán)境因素影響，在田間難以肉眼觀察和測量。因此，即使在育種群體中發(fā)生了交換，交換單株也難以被挑選出來。

根據(jù)N導(dǎo)入片段交換頻率低和累贅表型難以觀測的特點(diǎn)，可采用以下策略篩選短N(yùn)導(dǎo)入片段的育種材料：選擇一個(gè)Coker176類型的烤煙資源，與優(yōu)良感病親本回交，構(gòu)建包含上千個(gè)單株的回交群體，利用N導(dǎo)入片段的分子標(biāo)記從中篩選N導(dǎo)入片段的交換單株。

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