基于CXCR4啟動子的中藥有效成分高通量篩選細胞模型構(gòu)建和應(yīng)用

王強利 國海東 王奕 吳心語 趙亮 王瑩

摘要：目的 以CXCR4基因啟動子為靶點，建立促干細胞歸巢藥物篩選細胞模型，并對中藥單體進行篩選。方法 將人CXCR4基因啟動子序列（279 bp）插入熒光素酶報告基因載體pGL4.17-Basic中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL4.17-CXCR4，與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染293細胞，經(jīng)驗證CXCR4啟動子轉(zhuǎn)錄活性后，單細胞克隆培養(yǎng)以獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，并用于候選中藥單體1～10的篩選，最后應(yīng)用Western blot驗證所篩選出的中藥單體促進間充質(zhì)干細胞（MSCs）中CXCR4表達的作用。結(jié)果 成功建立藥物篩選細胞模型，篩選出候選單體6提高CXCR4啟動子活性的作用最強，Western blot結(jié)果證實候選單體6可明顯促進MSCs中CXCR4的表達。結(jié)論 本研究建立的藥物篩選細胞模型能實現(xiàn)對潛在促進干細胞歸巢中藥有效成分的高通量篩選。

關(guān)鍵詞：心肌梗死；干細胞移植；CXCR4/SDF-1軸；熒光素酶報告基因；細胞模型

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.012

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）11-0052-05

Abstract： Objective To establish a cell model targeting the CXCR4 gene promoter to screen of drugs potentially promoting the stem cell homing， and to screen the monomers of traditional Chinese medicine. Methods The human CXCR4 gene promoter sequence （279 bp） was inserted into the luciferase reporter vector pGL4.17-Basic to construct the recombinant plasmid pGL4.17-CXCR4， which was co-transfected with the internal reference plasmid pRL-TK into 293 cells. After verifying transcriptional activity of CXCR4 promoter， single cell clones were cultured to obtain a stable transfectant cell line and used for screening of candidate Chinese herbal monomer （1 to 10）. Finally， Western blot was used to verify the effect of the selected Chinese herbal monomer on the expression of CXCR4 in MSCs. Results The drug screening cell model was successfully established and the candidate monomer 6 was screened out because of the strongest effect on enhancing CXCR4 promoter activity. Western blot results verified that the candidate monomer 6 could promoted the expression of CXCR4 of MSCs. Conclusion The drug screening cell model established in this study was able to achieve high-throughput screening for potentially promoting the stem cell homing Chinese herbal monomer.

Keywords： myocardial infarction； stem cell transplantation； CXCR4/SDF-1 axis； luciferase reporter gene； cell model

心肌梗死（myocardial infarction，MI）后進行性心力衰竭是現(xiàn)代心臟病學的巨大挑戰(zhàn)。通過移植自體或異體間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell， MSCs）能增強心臟功能，縮小梗死面積，延緩心衰進程[1]。然而，移植后MSCs較低的心臟留存率嚴重影響了其治療效果。研究顯示，靜脈注射后僅有2%的干細胞歸巢至心臟，冠脈注射為15%，直接注射到心肌內(nèi)僅有11%的留存率，大部分細胞分散在肺、肝和脾[2]。因此，促進移植后更多的干細胞向MI區(qū)歸巢是增強MSCs治療MI作用的關(guān)鍵。CXC趨化因子受體4[chemokine（C-X-C motif） receptor 4，CXCR4]和其配體基質(zhì)細胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）在MSCs歸巢中發(fā)揮主要作用[3]。CXCR4是7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，通過與SDF-1特異性結(jié)合介導(dǎo)MSCs遷移、增殖和分化[4]。研究發(fā)現(xiàn)，提高MSCs表達CXCR4水平能增強細胞遷移和向MI區(qū)域歸巢的能力[5]，使用CXCR4阻斷劑AMD3100可明顯抑制干細胞向MI區(qū)域歸巢，使歸巢的細胞數(shù)量顯著減少[6]。因此，以CXCR4表達水平為考察對象，篩選能促進MSCs歸巢中藥單體，對于增強MSCs的治療作用和闡明中藥治療心血管疾病的機制都具有十分重要的意義。據(jù)此，本研究構(gòu)建了含CXCR4啟動子的雙熒光素酶報告系統(tǒng)的藥物高通量篩選模型，并驗證該細胞模型的可靠性。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物許可證號SYXK（滬）2014-0008。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學SPF級動物房，自由攝食飲水。

1.2 細胞株

293人胚腎上皮細胞為本實驗室培養(yǎng)。

1.3 藥物

人參皂苷Rb1和10種候選中藥單體均購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。

1.4 主要試劑與儀器

熒光素酶報告載體pGL4.17、海腎熒光素質(zhì)粒pRL-TK，優(yōu)寶生物；限制性內(nèi)切酶Xhol、Hind Ⅲ和T4 DNA連接酶，東洋紡（上海）生物科技有限公司；SuperFectin Ⅱ脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，上海普飛生物技術(shù)有限公司；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、普通質(zhì)粒小提試劑盒、胰蛋白胨、瓊脂糖及酵母提取物，天根生化試劑有限公司；G418、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1），上海翊圣生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，Promega公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素、細胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板，Corning公司；兔抗人多克隆、抗體GAPDH、CXCR4和HRP標記羊抗兔二抗，Proteintech公司。酶標儀（Synergy 2，BioTek公司），熒光活體成像系統(tǒng)（Lumina XR，PerkinElmer公司），化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（Tanon 5200，天能）。

2 實驗方法

2.1 CXCR4啟動子的合成

參考Wegner S A等[7]報道CXCR4啟動子DNA，設(shè)計一對互補序列，標記為CXCR4-F/R，5'端引入酶切位點Xhol，3'端引入酶切位點Hind Ⅲ。委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA序列如下。CXCR4-F：5'-CTCGAGTACCGACCACCCGCAAAC AGCAGGGTCCCCTGGGCTTCCCAAGCCGCGCACCTCTCCGCCCCGCCCCTGCGCCCTCCTTCCTCGCGTCTGCCCCTCTCCCCCACCCCGCCTTCTCCCTCCCCGCCCCAGCGGCGCATGCGCCGCGCTCGGAG

CGTGTTTTTATAAAAGTCCGGCCGCGGCCAGAAACTTCAGTTTGTTGGCTGCGGCAGCAGGTAGCAAAGTGACGCCGAGGGCCTGAGTGCTCCAGTAGCCACCGCATCTGGAGAACCAGCGGTTACCAAGCTT-3'；CXCR4-R：5'-AAGCTTGGTAACCGCTGGTTC TCCAGATGCGGTGGCTACTGGAGCACTCAGGCCCTCGGCGTCACTTTGCTACCTGCTGCCGCAGCCA ACAAACTGAAGTTTCTGGCCGCGGCCGGACTTTTATAAAAACACGCTCCGAGCGCGGCGCATGCGCCGCTGGGGCGGGGAGGGAGAAGGCGGGGTGGG

GGAGAGGGGCAGACGCGAGGAAGGAGGGCGCAGGGGCGGGGCGGAGAGGTGCGCGGCTTGGGAAGCCCAGGGGACCCTGCTGTTTGCGGGTGGTCG

GTACTCGAG-3'。

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

將合成的CXCR4啟動子DNA和熒光素酶報告載體pGL4.17進行Xhol和Hind Ⅲ雙酶切后，用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，雙酶切鑒定后獲得重組質(zhì)粒pGL4.17-CXCR4P，送至生工生物工程（上海）股份有限公司基因測序鑒定。將質(zhì)粒擴增后，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取無內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒，備用。見圖1。

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基37 ℃、5%CO2培養(yǎng)293細胞。將293細胞以5×105/mL密度接種于24孔板，待細胞生長至匯合80%，按SuperFectin Ⅱ脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，將重組質(zhì)粒pGL4.17- CXCR4P（200 ng/孔）和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK（60 ng/孔）共轉(zhuǎn)染至293細胞。同時，將質(zhì)粒pGL4.17和pRL-TK共轉(zhuǎn)染作為陰性對照組。

2.4 啟動子活性評價

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后更換細胞培養(yǎng)基，加入TGF-β1（2 ng/mL）誘導(dǎo)細胞24 h，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各孔熒光強度：PBS清洗細胞2次，各孔加入100 μL細胞裂解液，室溫振搖裂解20 min徹底裂解細胞。取20 μL細胞裂解液上清，加入100 μL熒光素酶檢測試劑Ⅱ，酶標儀設(shè)置為檢測化學發(fā)光，檢測方式為延遲2 s后讀取10 s內(nèi)熒光值，再加入海腎熒光素酶檢測試劑（Stop and Glo?），猝滅熒光后檢測海腎熒光素酶活性。熒光素酶活性=每組螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。將所測數(shù)值與陰性對照組熒光素酶活性值相比，轉(zhuǎn)染pGL4.17-CXCR4P組熒光素酶活性值為比較后的相對值。

2.5 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGL4.17-CXCR4P單克隆細胞株

將293細胞種植于6孔板，達到匯合90%時進行細胞轉(zhuǎn)染，24 h后換液，加入終濃度為1 mg/mL的G418繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)處理10 d后，PBS清洗死亡細胞，胰酶消化貼壁細胞，收集細胞后吹打成單細胞懸液，細胞以1個/孔密度種植于96孔板。待細胞克隆形成后，將各個克隆的細胞以相同密度接種于96孔板，24 h后，加入D-luciferin至終質(zhì)量濃度60 μg/mL， 熒光活體成像系統(tǒng)拍攝，選擇信號最強的單克隆擴大培養(yǎng)，并命名為293-CXCR4單克隆細胞。

2.6 藥物篩選

293-CXCR4單克隆細胞以1×104/mL鋪于96孔板，待細胞匯合度約90%～95%后無血清培養(yǎng)，加入候選中藥單體（8 μg/mL），參考Lan T H等[8]報道，將人參皂苷Rb1作為陽性對照藥物，不加入任何藥物作為陰性對照組。作用24 h 后，用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性值。將所測得數(shù)值與陰性對照組的熒光素酶活性值相比，陽性對照組和候選藥物組熒光素酶活性值為比較后的相對值。

2.7 異體間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)

應(yīng)用差速貼壁法分離骨髓中MSCs。將SD大鼠拉頸處死，用75%乙醇浸泡消毒8 min，分離雙側(cè)股骨和脛骨。剔除骨組織周圍組織后，暴露骨髓腔，用10 mL注射器抽取PBS沖洗骨髓腔，將帶有骨髓細胞的PBS收集于10 mL離心管，1000 r/min離心10 min。棄上清液，用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，以5×105個/mL密度均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3日更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞匯合70%～80%時傳代。取3～5代MSCs進行后續(xù)實驗。

2.8 Western blot檢測

將MSCs接種于6孔板，24 h后加入篩選出的中藥單體，處理24 h后收集MSCs，PBS清洗2遍，加RIPA裂解液，4 ℃裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，按Bradford法測定蛋白含量。加入5×loading buffer，于100 ℃變性5 min。將樣品加入10%SDS-PAGE膠樣品槽中，150 mV電泳50 min后，100 mV 轉(zhuǎn)膜1 h至硝酸纖維素膜。一抗4 ℃孵育過夜。TBST反復(fù)洗膜后，HRP標記二抗孵育1 h，洗膜后化學發(fā)光試劑顯色，用凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖片。

3 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad5.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒

瓊脂糖凝膠電泳成像顯示，Xhol和HindⅢ雙酶切產(chǎn)物在291 bp和5567 bp處有特異性條帶（見圖2），與理論值相一致。重組質(zhì)粒經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司基因測序鑒定后與CXCR4基因序列完全一致。以上結(jié)果表明成功構(gòu)建pGL4.17-CXCR4P重組質(zhì)粒。

4.2 檢測CXCR4啟動子活性

TGF-β1誘導(dǎo)24 h后，轉(zhuǎn)染pGL4.17-CXCR4P的熒光素酶活性相對值為19.7±0.32，見圖3。表明TGF-β1能增強CXCR4啟動子活性，提示該細胞模型可用于篩選增強CXCR4表達的中藥單體。

4.3 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株

為了保證雙熒光素酶反應(yīng)靈敏，篩選結(jié)果均一，將轉(zhuǎn)染pGL4.17-CXCR4P的293細胞進行單克隆培養(yǎng)，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，即293-CXCR4單克隆細胞株?；铙w成像熒光系統(tǒng)篩選結(jié)果顯示，3號單克隆細胞株光通量最強（見圖4），將其擴增后液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

4.4 篩選中藥單體

雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示：與陰性對照組比較，候選單體2、5、6、10組熒光素酶活性相對值明顯升高，候選單體3組CXCR4熒光素酶活性相對值明顯降低；候選單體6組熒光素酶活性相對值高于陽性對照組。以上結(jié)果說明，候選單體2、5、6、10能增強CXCR4啟動子活性，其中候選單體6作用最強，見圖5。

4.5 促進CXCR4表達初步驗證

為驗證本細胞模型的可靠性，本研究采用Western blot驗證篩選出的單體6促進MSCs表達CXCR4的作用。結(jié)果顯示，候選單體6能明顯增強MSCs中CXCR4表達，且具有劑量依賴性，見圖6。此結(jié)果證明該細胞篩選模型成功篩選出具有促進干細胞CXCR4表達作用的中藥單體。

5 討論

CXCR4/SDF-1軸在干細胞歸巢中發(fā)揮重要作用。CXCR4表達于多種干細胞膜，能與SDF-1特異性結(jié)合，介導(dǎo)干細胞向SDF-1表達區(qū)域遷移和黏附[4]。急性MI后，缺血部位的心肌組織分泌SDF-1，募集干細胞歸巢以修復(fù)受損組織。用體外培養(yǎng)的MSCs移植治療MI是干細胞研究的熱點，然而隨著傳代次數(shù)的增多，MSCs中CXCR4的表達水平顯著降低[9]，削弱其向受損心肌遷移的能力，嚴重降低了干細胞移植的治療效果，而通過基因修飾[10]等手段使MSCs過表達CXCR4則能明顯促進其向SDF-1分布區(qū)域的遷移。因此，以CXCR4為靶點，篩選出具有上調(diào)干細胞CXCR4表達水平的中藥單體，可能具有促進移植后干細胞歸巢的作用。

本研究將CXCR4啟動子基因片段和帶有熒光素酶基因的報告載體重組得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293細胞后，通過檢測熒光素酶的表達反映CXCR4啟動子的活性強弱。在此基礎(chǔ)上，通過單克隆培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達CXCR4啟動子的單克隆細胞株，利用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)篩選中藥單體。最后采用Western blot技術(shù)，初步證明篩選出的中藥單體對體外培養(yǎng)MSCs的CXCR4表達有顯著促進作用，驗證了該細胞篩選模型的可靠性。與傳統(tǒng)的篩選方法相比，應(yīng)用細胞模型篩選中藥單體，更接近體內(nèi)真實的生理環(huán)境，結(jié)果可靠性較高；同時，利用單克隆細胞株篩選具有結(jié)果均一性好、可重復(fù)性高等優(yōu)點；此外，利用雙熒光素酶報告基因，檢測CXCR4啟動子的活性，操作簡單，靈敏度高，實驗周期短，非常適用于中藥單體的高通量篩選。

CXCR4不僅介導(dǎo)干細胞歸巢，在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和艾滋病病毒感染T細胞的過程中均發(fā)揮重要作用[11]。因此，本研究建立的細胞篩選平臺不僅可用于干細胞治療MI中藥單體的篩選，也可用于抗腫瘤和抗艾滋病中藥單體的篩選，為傳統(tǒng)中藥的現(xiàn)代研究提供方法學參考。

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