11β-HSD1和11β-HSD2在妊娠期糖尿病患者胎盤組織中的差異表達及臨床意義

馬 蓉，劉 建，肖曉秋

(1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產科，烏魯木齊 830000；2.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦產科 400010；3.重慶醫(yī)科大學脂糖代謝實驗室 400016)

論著·臨床研究

11β-HSD1和11β-HSD2在妊娠期糖尿病患者胎盤組織中的差異表達及臨床意義

馬 蓉1，劉 建2△，肖曉秋2

(1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產科，烏魯木齊 830000；2.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦產科 400010；3.重慶醫(yī)科大學脂糖代謝實驗室 400016)

目的研究妊娠糖尿病患者胎盤組織中11β-羥類固醇脫氫酶(11β-HSD1)和11β-HSD2基因和蛋白表達的變化及意義。方法選擇妊娠期糖尿病(GDM)和糖耐量正常孕婦(NGT)各30例，化學發(fā)光法測定皮質醇、胰島素的水平，免疫組織化學法檢測11β-HSD1和11β-HSD2在胎盤的表達部位，分別運用熒光定量PCR(real time PCR)和Western blot法測試11β-HSD1和11β-HSD2基因和蛋白水平的差異表達。結果與NGT組相比，GDM組空腹胰島素、HOMA-IR、胰島素分泌指數(shù)、母血皮質醇水平明顯增高(P<0.05)，而空腹血糖、胎兒臍血皮質醇則差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。1β -HSD1和11β-HSD2均在胎盤中有表達，表達部位及水平不同。real time-PCR和Western blot檢測結果提示GDM組胎盤11β -HSD1 mRNA和蛋白的表達明顯低于NGT組(P<0.05)，11β -HSD2 mRNA明顯高于NGT組(P<0.05)，而蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論妊娠期糖尿病胎盤組織11β-HSD1和11β-HSD2差異表達調整免除母體不佳的妊娠環(huán)境將會給胎兒造成的長遠傷害。

糖尿病,妊娠；11β-HSDs；氫化可的松；胰島素抗藥性

妊娠期糖尿病(GDM)是指在妊娠期間首次發(fā)現(xiàn)的糖耐量異常。GDM會引起多種母嬰并發(fā)癥，尤其是對胎兒產生負面影響。它屬于成人疾病胎兒發(fā)病的關鍵致病因素之一。GDM母親所孕育的孩子在進入成年易出現(xiàn)肥胖、糖耐量異常等各種疾病。明確GDM所造成的危險及相應預防措施，抑制孕期出現(xiàn)糖代謝紊亂并有效限制GDM發(fā)病率的上升是極為重要的。其中，糖皮質激素不僅會對孕后期的胎兒發(fā)育造成影響，而且會推動孕婦分娩發(fā)動[1]。然而胎兒假如置于糖皮質激素水平過高的環(huán)境之內，極易出現(xiàn)病理妊娠，如胎兒發(fā)育緩慢、增大早產概率、出現(xiàn)先兆子癇癥狀等。在妊娠期間，母體所含皮質醇的水平極高，和臍靜脈血相比，它要多出5倍以上[2]，這意味著胎盤組織之內有著調整糖皮激素的有效阻隔，是一個生理屏障。當前針對這一胎盤屏障所具備的分子特性依然很少人知道。在人體之內，11β-羥類固醇脫氫酶(11β-HSDs)能夠讓活性的皮質醇和無活性的皮質酮不斷向對方轉變，進而調整部分靶器官糖皮質激素相應的活性，11β-HSD主要包含兩種類型：11β-HSD1和11β-HSD2。在妊娠過程中，胎盤滋養(yǎng)細胞能夠表達11β-HSDs[3]。本文旨在探討GDM患者血清及胎臍血皮質醇變化，通過母體-胎盤-胎兒循環(huán)來分析GDM胎盤組織中調節(jié)皮質醇代謝的11β-HSD1和11β-HSD2基因及蛋白出現(xiàn)相應的表達轉變情況，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 挑選2010年12月至2013年1月在重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院產科就診的30例實施剖宮產的GDM孕婦為研究對象，將之確定為GDM組，平均年齡(29.40±1.00)歲，平均孕前BMI(21.61±0.81)kg/m2，平均孕周(38.90±0.60)周，經過診斷，查出妊娠期糖尿病的周期多在妊娠24～28 周，這一類型的孕婦可以借助飲食和運動來調控血糖，效果大致符合預期。選取同期糖代謝正常的孕婦30例作為對照組(NGT組)，平均年齡(30.90±0.50)歲，平均孕前BMI(22.23±0.51)kg/m2，平均孕周(38.30±0.70)周，GDM診斷標準參照婦產科學第8版教材[4]。兩組孕婦都沒有高血壓及肝腎功能異常的病癥，也沒有表現(xiàn)出多囊卵巢綜合征的癥狀，它們在年齡、孕周等指標方面的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在患者認可之后簽訂知情同意書收集患者血液，以及各自的胎盤組織樣本。新生兒體質量經清理呼吸道后使用電子秤稱取。

1.2方法

1.2.1標本收集 (1)手術當天抽取兩組孕婦空腹肘靜脈血，母血之內各個生化指數(shù)監(jiān)測運用全自動生化分析儀對之進行解析。在胎盤娩出之后，即刻收集臍帶血，將血清分離之后放于-20 ℃冰箱進行保存待檢測；(2)在胎盤完全分娩之后，保證無菌環(huán)境，從臍帶根部胎盤母面中部提取檢測對象，尺寸為1.5 cm×1.5 cm，不能挑選機化或者鈣化的部分，運用磷酸鹽緩沖液(PBS)前后沖洗3次，將組織分割為3份，其中1份置于4%多聚甲醛之內，將之固定24 h之后實施脫水，使用蠟塊進行封存固定，另一份置于-80 ℃冰箱待用。

1.2.2臨床指標監(jiān)測 葡萄糖氧化酶法測驗血糖，化學發(fā)光法監(jiān)測空腹胰島素，運用全自動生化分析儀對其相應的生化指標進行監(jiān)測，運用穩(wěn)態(tài)模型評估法(HOMA)求解胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。母親靜脈血皮質醇、新生兒臍血皮質醇水平測定采用化學發(fā)光法。

1.2.3胎盤組織中11β-HSD1和11β-HSD2 蛋白表達測定 (1)一抗蛋白孵育：把穩(wěn)定好的胎盤組織封存為蠟塊，對之進行切片，去除玻片上的蠟塊，使用梯度乙醇進行脫水，運用PBS沖洗2～3次，每次5 min后，枸櫞酸鹽緩沖液進行熱修復，PBS沖洗3次，每次5 min。在玻片之上滴入3%H2O2,室溫靜置10 min，PBS洗3次，每次3 min。11β-HSD1蛋白檢測運用免疫組織化學(SP)法。而11β-HSD2蛋白檢測加入一般山羊血清對之進行封閉，保持37 ℃，20 min后添加10 μL一抗，保持37 ℃恒溫2 h，按照說明書準則，一抗稀釋比例1∶100，PBS 洗3次，每次3 min。(2)二抗IgG標記：11β-HSD1蛋白加入Polymer Helper,測試環(huán)境37 ℃，PBS沖洗3次之后，添加poly-HRP anti -Goat IgG，其測試環(huán)境和相關操作程序如上。11β-HSD2蛋白直接加入HRP，對山羊抗兔IgG進行標記，依然保持37 ℃恒溫，孵育20 min，PBS 洗3次，每次3 min。(3)顯色及封片：DAB顯色5～10 min，通過顯微鏡把握染色程度。使用PBS或自來水進行沖洗，維持10 min，運用蘇木精進行復染，維持4 min，運用碳酸鋰對顏色進行固定，保持30 s，之后再運用鹽酸乙醇對之進行分化，保持2 s，通過自來水進行沖洗，保持10～15 min，通過梯度乙醇進行脫水，通過中性樹膠進行封片，給予鏡檢：棕黃色著色為陽性。

1.2.4實時熒光定量PCR(real time-PCR)法檢測胎盤組織中11β-HSD1和11β-HSD2水平 (1)引物合成：由上海鼎安生物科技有限公司負責合成，11β-HSD1引物序列(正向：5′-AAG TTG CAG TGA GCC GAG ATC-3′；反向：5′-TTC CGA GGC AGA GTC TTG CT-3′，AY044083)。11β-HSD2引物序列(正向：5′-GGC CAA GGT TTC CCA GTG A-3′；反向：5′-GAG GGT GTT TGG GCT CAT GA-3′，NM_000196)；(2)組織總RNA的提取：取100 mg胎盤組織，加入Trizol 1 mL，抽取胎盤總RNA，操作以說明書為準。取2 μg RNA進行反轉錄反應，所用反轉錄試劑盒來自于大連TaKaRa公司。(3)real time-PCR監(jiān)測基因表達：對cDNA進行稀釋，保持原含量的1/10，取2 μL與SYBR premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa)及引物開展PCR反應，將原體系擴增至10 μL，反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 變性10 s,退火 60 ℃ 30 s,65 ℃ 5 s,39個循環(huán)，溶解曲線保持在65～95 ℃，β-actin做內參，所生成的物品的特異性運用溶解曲線給予評定，最終定量結果用2-△△Ct給予計算。

1.2.511β-HSD1和11β-HSD2蛋白表達的測定 取胎盤組織80 mg，通過裂解液及電動勻漿器對之進行勻漿處理，保持4 ℃低溫離心15 min，提取上清液蛋白。(2)通過BCA蛋白定量試劑進行(廠家：自碧云天生物公司)定量，提取80 μg蛋白加入5×上樣緩沖液100 ℃煮沸10 min。12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，操作完成后，將之轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%牛奶，室溫下封閉1 h，11β-HSD1、11β-HSD2一抗(1∶1 000，Santa Cruze公司)，室溫環(huán)境下加一抗孵育1 h,4 ℃過夜；TBST漂洗；室溫狀態(tài)下二抗(1∶3 000)孵育1 h。(3)ECL顯影成像。Quantity One軟件解析兩組灰度比值確定蛋白11β-HSD1和11β-HSD2相對表達量。

2 結 果

2.1臨床資料分析 與NGT組比較，GDM組患者經過內分泌科嚴格飲食控制和適量運動，手術當天空腹血糖[(4.60±0.20)mmol/Lvs.(4.60±0.10)mmol/L]，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與NGT組比較手術當天GDM組空腹胰島素[(12.93±1.50)mU/Lvs. (19.95±1.05)mU/L]、HOMA-IR(2.87±0.4vs. 4.54±0.67)、胰島素分泌指數(shù)(53.15±5.58vs. 80.55±6.18)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2皮質醇變化及相關性分析 與NGT組的母血皮質醇水平[(934.10±45.92)nmol/L]比較，GDM組[(1 110.0±40.9)nmol/L]明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1A。而兩組之間的臍血皮質醇及新生兒體質量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1B、C。將兩組胎兒皮質醇的監(jiān)測結果進行對比，新生兒的體質量與其母血及胎兒臍血皮質醇水平不相關(圖1D)，而與胎兒臍血皮質醇水平呈現(xiàn)負相關關系(r=-0.31，P=0.01)，見圖1E。

2.3免疫組織化學結果 11β-HSD1蛋白廣泛遍布于絨毛及干絨毛的合體滋養(yǎng)層外層、絨毛間質；11-β-HSD2表達集中分布于絨毛合體滋養(yǎng)層細胞外層，見圖2。

A:母血皮質醇；B：胎兒臍血皮質醇；C：胎生出生體質量；D：母血皮質醇與胎兒出生體質量的關系；E:胎兒臍血皮質醇與胎兒出生體質量的關系

圖1母血、臍血皮質醇變化及與胎兒體質量變化及相關性分析

A:絨毛合體滋養(yǎng)層外層(11β-HSD1)；B：干絨毛的合體滋養(yǎng)層；C：絨毛間質(11β-HSD1)；D：絨毛合體滋養(yǎng)層(11β-HSD2)

圖2 11β-HSD1蛋白和11β-HSD2蛋白在胎盤中的表達部位

a:P<0.05

圖3 real time-PCR結果

圖4 Western blot結果

2.411β-HSD1、11β-HSD2基因及蛋白水平表達 real time-PCR結果提示GDM組胎盤11β-HSD1 mRNA的表達明顯低于NGT組(0.56±0.09vs. 1.36±0.36，P<0.05)。11β-HSD2 mRNA明顯高于NGT組(5.17±1.02vs. 1.21±0.34，P<0.05)。Western blot法結果提示GDM組胎盤11β-HSD1 蛋白水平的表達明顯低于NGT組(0.27±0.07vs.1.00±0.19，P<0.05)，而11β-HSD2蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(1.30±0.19vs.1.00±0.14，P>0.05)。見圖3、4。

3 討 論

當前，針對GDM的探究大多認與胰島素抵抗有關，GDM患者多數(shù)出現(xiàn)胰島素敏感性下降，其抵抗情況加劇，脂代謝出現(xiàn)異常[5]。當前的研究大多圍繞與胰島素抵抗有關的因子進行，例如瘦素、脂聯(lián)塑等。出現(xiàn)脂肪代謝異常及體型肥胖的患者一般均會出現(xiàn)血清瘦素、脂聯(lián)素水平下降，抵抗素增加。且胰島素抵抗及Ⅱ型糖尿病的發(fā)病率更高[6-7]。胎盤是連接母體及胎兒的主要器官，能夠生成激素和酶。對于妊娠期孕婦而言，糖皮質激素能夠對胰島素產生一定對抗。它可以通過葡萄糖所進行的跨膜運轉，改變胰島素的受體來改變胰島素相應的敏感性。同時，它還可以直接干擾胰島素抵抗的生成，而胰島素β細胞也許是它引起糖尿病的主要靶點[8]。在孕婦體內，糖皮質激素通過皮質醇的方式發(fā)生作用。它可影響胎兒發(fā)育，胎兒長時間處于高皮質醇環(huán)境之內，會導致低體質量兒的發(fā)病率提升。

本研究選擇的對象為妊娠期糖尿病患者，通過調整飲食和血糖，手術當日GDM組空腹血糖水平保持正常，然而仍然有胰島素抵抗特征。經過監(jiān)測，和GDM組胰島素抵抗相對的，GDM組母血皮質醇水平也有明顯提高，但是胎兒臍血皮質醇水平及胎兒的體質量都未出現(xiàn)顯著改變。因此，新生兒的體質量，不受到母血皮質醇的影響，而胎兒臍血皮質醇水平與之存在負相關關系。在母體血液-胎盤-臍血的血流運行過程中，母體出現(xiàn)高皮質醇血病的占比增長，而胎兒臍血皮質醇變動不大。母體循環(huán)及臍血皮質醇中間的差別也許是胎盤部分調整糖皮質激素的因子具有屏障效用。而在胎盤之內，具有此種效用的分子為11β-HSDs，它們能夠催化活性的皮質醇和無活性的皮質酮之間的相互轉化，從而調節(jié)局部糖皮質激素的活性。11β-HSD1屬于同時兼具氧化和還原雙重效用的酶，在體內主要發(fā)揮還原酶的效用，將會讓糖皮質激素增加。而氧化反應則要求有NADP+/NADPH參加。11β-HSD2只發(fā)揮氧化酶的效用，使皮質醇轉變?yōu)槠べ|酮，可以削減糖皮質激素的影響，而發(fā)生還原反應則要有NAD+的參加[9]。

對于妊娠期患者而言，胎盤是其內分泌器官的一部分，不僅能夠生成蛋白類激素，而且還具有類固醇激素的效用[10,11]。妊娠期患者，能夠檢查到11β-HSDs的表達。11β-HSD1則遍布于絨毛單位間質等部位，11β-HSD2大多位于絨毛合體滋養(yǎng)層，這意味著在胎盤絨毛組織之內，調整糖皮質激素代謝過程的屏障因子有一定的位置。real time-PCR顯示：GDM組胎盤11β-HSD1 mRNA的表達更為明顯，而NGT組之內11β-HSD2的表達更為突出。Western blot法的檢查結果顯示，GDM之內的11β-HSD1水平較低，而11β-HSD2水平增長無統(tǒng)計學意義。在GDM組出現(xiàn)病理妊娠的時候，其對糖皮質激素的影響削弱。有資料證明，低體質量兒體內的臍血皮質醇顯著增長，而其胎盤組織之內的11β-HSD2的影響下降[12-13]，原因大概是這一物質的屏障效應失活導致的臍血皮質醇水平紊亂，皮質醇借助胎盤導致胎兒部分受損[14]。目前普遍接受的觀點認為妊娠狀態(tài)下，無論是胎盤11β-HSD2的表達，還是糖皮質激素的分泌，都被各類病理要素干擾。近年，11β-HSD2的代謝調整成為研究熱門。它是胎盤糖皮質激素能夠發(fā)揮屏障作用主要物質，可造成母體流入大量皮質醇，導致胎兒發(fā)育受損。本實驗通過飲食調整的GDM患者，在其胎盤之內，11β-HSD1表達的下降而11β-HSD2表達的升高對胎兒臍血皮質醇水平的平穩(wěn)有一定影響，前者的下降也許影響了轉錄和翻譯進程，而后者的升高僅影響轉錄。此種保護機制調整的緣由有待于進一步探討研究。11β-HSD1和11β-HSD2基因可作為新的研究基因靶點，用來研究中國人群的11β-HSD1和11β-HSD2基因的微衛(wèi)星多態(tài)性與胎兒發(fā)育、孕晚期胎兒器官發(fā)育及妊娠之間的關系。

[1]Mericq V,Medina P,Kakarieka E,et al.Differences in expression and activity of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 and 2 in human placentas of term pregnancies according to birth weight and gender[J].Eur J Endocrinol,2009,161(3):419-425.

[2]Clarke KA,Ward JW,Forhead AJ,et al.Regulation of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 activity in ovine placenta by fetal cortisol[J].J Endocrinol,2002,172(3):527-534.

[3]Sun K ，Yang K ，Challis JR.Differential expression of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase types 1 and 2 in human placenta and fetal membranes[J].J Clin Endocrinol Metab,1997,82(1):300-305.

[4]謝幸，茍文麗．婦產科學[M]．8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：75-79．

[5]Yang H,Wei Y,Gao X,et al.Risk factors for gestational diabetes mellitus in Chinese women:a prospective study of 16 286 pregnant women in China[J].Diabet Med,2009,26(11):1099-1104.

[6]Seckl JR,Holmes MC.Mechanisms of disease:glucocorticoids,their placental metabolism and fetal ′programming′ of adult pathophysiology[J].Nat Clin Pract Endocrinol Metab,2007,3(6):479-488.

[7]Clausen TD,Mathiesen ER,Hansen T,et al.High prevalence of type 2 diabetes and pre-diabetes in adult offspring of women with gestational diabetes mellitus or type 1 diabetes:the role of intrauterine hyperglycemia[J].Diabetes Care,2008,31(2):340-346.

[8]Chapman K,Holmes M,Seckl J.11β-hydroxysteroid dehydrogenases:intracellular gate-keepers of tissue glucocorticoid action[J].Physiol Rev,2013,93(3):1139-1206.

[9]Gathercole LL,Bujalska IJ,Morgan SA,et al.Glucocorticoid and insulin regulation of lipogenesis in human adipose tissue[J].Endocr J,2010,57(2):S408.

[10]Johnstone JF,Bocking AD,Unlugedik E,et al.The effects of chorioamnionitis and betamethasone on 11beta hydroxysteroid dehydrogenase types 1 and 2 and the glucocorticoid receptor in preterm human placenta[J].J Soc Gynecol Investig,2005,12(4):238-245.

[11]Julan L,Guan H,Van Beek JP,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor delta suppresses 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 gene expression in human placental trophoblast cells[J].Endocrinology,2005,146(3):1482-1490.

[12]Clarke KA,Ward JW,Forhead AJ,et al.Regulation of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 activity in ovine placenta by fetal cortisol[J].J Endocrinol,2002,172(3):527-534.

[13]Bertram C,Trowern AR,Copin N,et al.The maternal diet during pregnancy programs altered expression of the glucocorticoid receptor and type 2 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase:potential molecular mechanisms underlying the programming of hypertension in utero[J].Endocrinology,2001,142(7):2841-2853.

[14]Tzschoppe A,Struwe E,Blessing H,et al.Placental 11beta-HSD2 gene expression at birth is inversely correlated with growth velocity in the first year of Life after intrauterine growth restriction[J].Pediatr Res,2009,65(6):647-653.

Differentialexpressionofplacentaltissue11β-HSD1and11β-HSD2inpatientswithgestationaldiabetesmellitus

MaRong1,LiuJian2△,XiaoXiaoqiu3

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Xinjiang,Urumqi830000,China;2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;3.LipidSugarMetabolismLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo study the changes and significance of 11β-HSD1 and 11β-HSD2 gene and protein expression in placenta of patients with gestational diabetes mellitus.MethodsThirty pregnant women with gestational diabetes mellitus (GDM) and normal glucose tolerance (NGT) were selected.Chemiluminescence was used to determine the serum cortisol,neonatal cord blood cortisol and fasting insulin ect.Immunohistochemistry was used to detect the expression location of 11β-HSD1 and 11β-HSD2 in the placenta.The differential expression of 11β-HSD1 and 11β-HSD2 genes and proteins were detected by real-time PCR and Western blot.ResultsCompared with NGT group,fasting insulin,HOMA-IR,insulin secretion index and maternal serum cortisol level were significantly increased in GDM group [(19.95±1.05) mU/Lvs. (12.93±1.50) mU/L,4.54±0.67vs. 2.87±0.43,80.55±6.18vs. 53.15±5.58,(1 110.00±40.91) nmol/Lvs. (934.1±45.92) nmol/L,P<0.05)],but there were no significant differences were found in fasting blood glucose and cord blood cortisol(P>0.05).The distribution of 11β-HSD1 in the placenta was distributed in the outer layer of villous syncytiotrophoblast,villous interstitial and dry villi.The expression of 11β-HSD2 was concentrated in the outer layer of villous syncytiotrophoblast.Real time-PCR and Western blot results showed that the expression of 11β-HSD1 mRNA and protein in placenta of GDM group was significantly lower than that of NGT group (0.56±0.09vs. 1.36±0.36,0.27±0.07vs. 1.00±0.01,P<0.05 ),11β-HSD2 mRNA was significantly higher than NGT group (5.17±1.02 and 1.21±0.34 respectively,P<0.05),but no significant difference was found in protein level (P>0.05).ConclusionThe differential expression of 11β-HSD1 and 11β-HSD2 in placenta of gestational diabetes mellitus can avoid the maternal poor pregnancy environment,but will cause long-term harm to the fetus.

] diabetes,gestational;11β-HSDs;hydrocortisone;insulin resistance

馬蓉(1984-),主治醫(yī)師，碩士，主要從事婦產科代謝疾病研究?！?/p>

，E-mail:Liu6898@sina.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.029

R714.256;R587.1;R363

A

1671-8348(2017)36-5126-04

2017-08-10

2017-09-26)