雙孢蘑菇培養(yǎng)料隧道發(fā)酵過(guò)程中胞外降解酶活性的變化

朱燕華，王 倩，宋曉霞，張津京，李正鵬，陳 輝，黃建春

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 201403）

雙孢蘑菇培養(yǎng)料隧道發(fā)酵過(guò)程中胞外降解酶活性的變化

朱燕華，王 倩，宋曉霞，張津京，李正鵬，陳 輝，黃建春*

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 201403）

研究了雙孢蘑菇培養(yǎng)料隧道式發(fā)酵各階段主要降解酶活性的變化情況。結(jié)果表明：各降解酶的酶活性呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。纖維素降解酶分別在不同發(fā)酵階段起作用，Cx酶活力在2次轉(zhuǎn)倉(cāng)時(shí)達(dá)到峰值，而C1酶與BG酶的酶活力分別在二次料與一次料中最高。半纖維素降解酶中的木聚糖酶活力呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，在2次轉(zhuǎn)倉(cāng)時(shí)酶活力最高，而木糖苷酶的活力一直較低。木質(zhì)素降解酶（Lac、MnP與LiP）的活力變化趨勢(shì)一致，均呈先上升后下降，再上升然后再下降的變化趨勢(shì)，在2次轉(zhuǎn)倉(cāng)時(shí)各酶活力達(dá)到峰值。蛋白酶活力在1次轉(zhuǎn)倉(cāng)時(shí)最高，此后開始下降，在二次料中再次升高。淀粉酶活力僅在培養(yǎng)料開始發(fā)酵的時(shí)期較高，此后的酶活力一直較低。培養(yǎng)料中的木質(zhì)素在1次轉(zhuǎn)倉(cāng)階段降解最快，而纖維素和半纖維素降解最快的時(shí)期是在2次轉(zhuǎn)倉(cāng)階段。

雙孢蘑菇；培養(yǎng)料；發(fā)酵；酶活力

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是世界上栽培與消費(fèi)最為廣泛的食用菌［1］。栽培雙孢蘑菇的原材料經(jīng)過(guò)堆制后，形成有利于雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)，而不利于其他雜菌生長(zhǎng)的具有“選擇性”的培養(yǎng)料。培養(yǎng)料的質(zhì)量是影響雙孢蘑菇產(chǎn)量與質(zhì)量的關(guān)鍵因素［2］，而堆肥中的微生物在培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［3］。雙孢蘑菇堆肥過(guò)程中的微生物群落種類與數(shù)量不斷演替，微生物活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的胞外酶種類與活力大小也隨之不斷變化，促進(jìn)堆肥各階段培養(yǎng)料中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用，從而形成了可促進(jìn)雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)的具有“選擇性”的營(yíng)養(yǎng)源［4］。目前對(duì)于不同雙孢蘑菇栽培的培養(yǎng)料配方方面的研究較多［5］，而對(duì)雙孢蘑菇隧道式發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落與功能、微生物的降解酶系變化規(guī)律方面的研究較少［6］。國(guó)內(nèi)企業(yè)雙孢蘑菇堆肥生產(chǎn)過(guò)程中仍主要憑借生產(chǎn)技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)來(lái)主觀判斷，導(dǎo)致目前我國(guó)的雙孢蘑菇工廠化生產(chǎn)企業(yè)在堆肥的生產(chǎn)過(guò)程中，常出現(xiàn)培養(yǎng)料堆制過(guò)生或過(guò)熟、二次料氨氣無(wú)法排盡抑制雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng)、堆肥的“選擇性”差致使栽培過(guò)程中雜菌滋生，大面積減產(chǎn)等問(wèn)題，引發(fā)重大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究對(duì)工廠化隧道式發(fā)酵的雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中的主要物質(zhì)降解酶活性進(jìn)行測(cè)定，分析發(fā)酵各階段的物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化特點(diǎn)，以期為進(jìn)一步研究微生物群落在雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵中的功能及合理制定雙孢蘑菇堆肥技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

雙孢蘑菇（A.bisporus）A15菌種，由美國(guó)Sylvan公司提供。

1.2 試驗(yàn)材料

堆肥配方為：稻草 23 t、麥草 15 t、棉籽殼 2 t、菜籽餅 2 t、石膏 2.5 t、碳酸鈣 1 t。

1.3 培養(yǎng)料發(fā)酵

試驗(yàn)地點(diǎn)為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院金山雙孢蘑菇種植基地。雙孢蘑菇的培養(yǎng)料發(fā)酵采用二次發(fā)酵工藝。全麥草配方中的麥草預(yù)濕后與雞糞、石膏等均勻混合后，在一次發(fā)酵槽中進(jìn)行發(fā)酵。60%稻草配方中的麥草提前2 d進(jìn)行預(yù)濕，然后再與稻草、雞糞、石膏、棉籽餅等均勻混合。此后每隔2—3 d轉(zhuǎn)倉(cāng)一次，轉(zhuǎn)倉(cāng)3—4次后，完成一次發(fā)酵，持續(xù)時(shí)間約14 d左右。將一次料運(yùn)至二次發(fā)酵隧道中，進(jìn)行密閉式發(fā)酵，通過(guò)調(diào)節(jié)通風(fēng)量控制培養(yǎng)料的溫度，依次經(jīng)過(guò)均溫、巴氏消毒、空氣調(diào)節(jié)及冷卻階段，測(cè)定氨氣濃度低于0.005‰時(shí)，即可降溫完成二次發(fā)酵過(guò)程，持續(xù)時(shí)間約7 d左右。二次料運(yùn)至菇房中，播撒雙孢蘑菇菌種，播種量為培養(yǎng)料干重的0.7%，采用上料機(jī)將培養(yǎng)料放于床架上進(jìn)行發(fā)菌、出菇等栽培管理。

1.4 取樣方法

取樣階段為：進(jìn)倉(cāng)、1次轉(zhuǎn)倉(cāng)、2次轉(zhuǎn)倉(cāng)、3次轉(zhuǎn)倉(cāng)、4次轉(zhuǎn)倉(cāng)、一次料、二次料共7個(gè)取樣時(shí)期。

取樣時(shí)，將發(fā)酵隧道中的樣品分為3段取樣，即隧道前中后3個(gè)位置。每個(gè)位置間隔距離約5 m。在每個(gè)取樣位置的剖面，按高度分為上（頂部往下10—20 cm）、中、下（地面以上10—20 cm）3個(gè)部分，五點(diǎn)梅花形取樣，每個(gè)點(diǎn)取樣100 g，將每個(gè)剖面的5個(gè)樣品混勻后，采用四分法取樣，每個(gè)取樣時(shí)期的培養(yǎng)料樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.5 測(cè)定方法

粗酶液提?。簠⒄諚钚旅溃?］的方法，從料面下2—3 cm處均勻取樣5 g，加入25 mL水，25℃搖床浸取1 h，轉(zhuǎn)速為150 r/min，然后4 000 r/min、5℃離心10 min，取上清液（或用四層紗布過(guò)濾，過(guò)濾液即為粗酶液），立即測(cè)定或于-30℃冰箱中保存待測(cè)。

纖維素酶活性測(cè)定：纖維素酶是一種復(fù)合酶系，由外切葡聚糖纖維二糖水解酶（C1酶）、內(nèi)切葡聚糖酶（Cx酶）和β-葡聚糖苷酶（BG）組成，Cx酶、BG酶、C1酶活性的測(cè)定采用DNS法［8］。Cx酶與BG酶活力單位為1 mL酶液1 h產(chǎn)生1μmol葡萄糖為1個(gè)酶活力單位（U），C1酶活力單位為1 mL酶液24 h產(chǎn)生1μmol葡萄糖為1個(gè)酶活力單位（U）。

半纖維素酶活性測(cè)定：半纖維素降解酶主要為內(nèi)切木聚糖酶與β-木糖苷酶。木聚糖酶與β-木糖苷酶活性的測(cè)定分別參照趙超等［8］與Cai等［9］。半纖維素的酶活力單位為1 mL酶液1 h產(chǎn)生1μmol葡萄糖為 1個(gè)酶活力單位（U）［8］。

木質(zhì)素酶活性測(cè)定：木質(zhì)素降解酶主要包含3個(gè)酶系：漆酶（Lac）、錳過(guò)氧化物酶（MnP）和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP），木質(zhì)素降解酶活性的測(cè)定方法參照 Buswell等［10］。Lac酶活力單位（U）＝（A×106）/（∑420×d），其中 A＝60 s內(nèi)吸收值的增加量，d＝光路（cm），比色皿的直徑；消光系數(shù)∑420＝3.6×104/（mol·cm）［11］。MnP酶活力單位（U）＝（A×106）/（∑240×d），其中 A＝60 s內(nèi)吸收值的增加量，d＝光路（cm）；消光系數(shù)∑240＝8.1×103/（mol·cm）［12］。LiP酶活力單位（U）為1 min內(nèi)在310 nm處引起吸光度值變化0.1所需的酶量［13］。

蛋白酶活力測(cè)定：參照倪新江等［14］的方法，蛋白酶活力單位（U）為每克干培養(yǎng)物30 min內(nèi)改變0.1個(gè)光密度值。淀粉酶活力測(cè)定：參照王玉萬(wàn)等［15］，淀粉酶活力單位（U）為每克干物質(zhì)30 min內(nèi)反應(yīng)生產(chǎn)1 mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中纖維素酶活性的變化

Cx酶作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生大量有非還原端的小分子纖維素。在培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中，堆肥中的Cx酶活力呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，在2次轉(zhuǎn)倉(cāng)時(shí)酶活力達(dá)到高峰，為12.4 U/g，此后開始下降。C1酶主要作用于纖維素線狀分子的末端，水解β-1，4糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子。C1酶活力在一次發(fā)酵過(guò)程中普遍較低，在二次料中的C1酶活力達(dá)到峰值，為8.24 U/g；BG酶的作用主要為將纖維二糖水解成葡萄糖分子，BG酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，在一次發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到峰值，二次料發(fā)酵結(jié)束后的BG酶活力再次降低。上述結(jié)果表明，纖維素降解復(fù)合酶系中的各種酶在雙孢蘑菇隧道式發(fā)酵不同階段發(fā)揮降解功能。

2.2 培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中半纖維素酶活性的變化

在雙孢蘑菇堆肥發(fā)酵過(guò)程中，降解半纖維素的主要酶為內(nèi)切木聚糖酶，其作用主要為隨機(jī)切斷木聚糖骨架，產(chǎn)生木寡糖，降低聚合度。木聚糖酶活力呈先下降后上升，此后再下降的趨勢(shì)，木聚糖酶的峰值出現(xiàn)在2次轉(zhuǎn)倉(cāng)開始時(shí)，酶活力達(dá)162.9 U/g，在3次轉(zhuǎn)倉(cāng)時(shí)迅速下降至53.5 U/g。β-木糖苷酶的作用是將木寡糖和木二糖分解為木糖。相對(duì)于木聚糖酶，在雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中的β-木糖苷酶活力較低，表明在雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中，木聚糖酶在半纖維素降解中起主要作用。

圖1 培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中纖維素酶活性的變化Fig.1 Changes of cellulase activity during com post fermentation

圖2 培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中半纖維素酶活性的變化Fig.2 Changes of hem icellulose activity during compost fermentation

2.3 培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中木質(zhì)素酶活性的變化

培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中的木質(zhì)素降解復(fù)合酶系呈類似的變化趨勢(shì)，Lac、MnP與LiP這3種酶的活力在剛開始發(fā)酵時(shí)均逐漸上升，在第2次轉(zhuǎn)倉(cāng)開始時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)酶活力最高的為L(zhǎng)ac，其次為MnP，LiP的酶活力最低。第3次轉(zhuǎn)倉(cāng)時(shí)，這3種木質(zhì)素降解酶的活力均開始下降，在一次發(fā)酵結(jié)束時(shí)這3種酶的活力再次升高，二次發(fā)酵結(jié)束后，酶活力均再次下降。

2.4 培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶與淀粉酶活性的變化

雙孢蘑菇培養(yǎng)料中富含蛋白質(zhì)，在發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶活力也呈規(guī)律性變化，總體呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)。蛋白酶活力的峰值出現(xiàn)在1次轉(zhuǎn)倉(cāng)時(shí)，酶活力為17.5 U/g，表明此階段微生物大量轉(zhuǎn)化利用培養(yǎng)料中的氨基酸等小分子。此后，蛋白酶活力開始迅速下降，在一次發(fā)酵結(jié)束時(shí)最低，為0.6 U/g，但二次發(fā)酵結(jié)束時(shí)，堆肥中的蛋白酶活力又再次升高，達(dá)10.7 U/g，表明二次料中的微生物對(duì)蛋白質(zhì)的降解利用較為旺盛。在進(jìn)一次發(fā)酵倉(cāng)時(shí)，培養(yǎng)料中的淀粉酶活力最高，此后逐漸下降，在2次轉(zhuǎn)倉(cāng)時(shí)降至最低，酶活力為0.36 U/g，此后堆肥各階段的淀粉酶活力一直維持在較低的水平，表明在剛開始發(fā)酵時(shí)，微生物將易被利用的淀粉作為碳源，培養(yǎng)料中的淀粉等物質(zhì)在2次轉(zhuǎn)倉(cāng)前就已基本被微生物所利用消耗。

圖3 培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中木質(zhì)素酶活性的變化Fig.3 Changes of ligninase activity during compost fermentation

圖4 培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶與淀粉酶活性的變化Fig.4 Changes of protease activity and amylase activity during compost fermentation

2.5 培養(yǎng)料發(fā)酵各階段培養(yǎng)料的木質(zhì)纖維素降解率

雙孢蘑菇培養(yǎng)料中的木質(zhì)素在二次發(fā)酵結(jié)束時(shí)的降解率為27.0%，其中在1次轉(zhuǎn)倉(cāng)階段降解速率最快，木質(zhì)素降解率約占整個(gè)發(fā)酵階段降解率的42.2%。培養(yǎng)料中纖維素與半纖維素在二次發(fā)酵結(jié)束時(shí)的降解率分別為57.9%與59.8%，其中在2次轉(zhuǎn)倉(cāng)階段的降解速率最快，降解率分別為38.4%與39.0%。

圖5 培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中木質(zhì)纖維素降解率的變化Fig.5 Changes of lignocellulose degradation rate during com post fermentation

3 討論

本研究表明，該批次的培養(yǎng)料栽培雙孢蘑菇的三潮菇總產(chǎn)量為25.4 kg/m2，表明培養(yǎng)料的質(zhì)量較好。在雙孢蘑菇培養(yǎng)料隧道式發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)料中主要物質(zhì)降解酶系的酶活力呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，在2次轉(zhuǎn)倉(cāng)開始時(shí)的木質(zhì)素降解酶（Lac、MnP與LiP）、纖維素降解酶（Cx酶）及半纖維素降解酶（木聚糖酶）的酶活力均達(dá)到峰值，表明在堆肥過(guò)程中2次轉(zhuǎn)倉(cāng)開始時(shí)的微生物對(duì)培養(yǎng)料中主要成分的降解轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)。此外，一次發(fā)酵料中的3種木質(zhì)素降解酶與BG酶活力也較高。二次發(fā)酵料中可能由于存在大量的細(xì)菌殘?bào)w蛋白［16］，有利于其他微生物進(jìn)行生長(zhǎng)利用，因而二次料的蛋白酶活力也較高。李曉博等［6］采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中酶活性變化的研究表明，半纖維素酶活力在第2次翻堆時(shí)最高，纖維素酶活力在第4次翻堆時(shí)最高，而漆酶活力在第3次翻堆時(shí)最高，酶活力峰值的出現(xiàn)時(shí)間均低于本研究中利用隧道進(jìn)行培養(yǎng)料發(fā)酵，這可能是由于隧道式發(fā)酵環(huán)境更有利于微生物群落快速繁殖與演替，從而加速了發(fā)酵進(jìn)程。侯曉偉等［17］研究表明，利用大麥秸稈作為原材料進(jìn)行雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵，培養(yǎng)料中的纖維素和半纖維素降解最快的時(shí)期在第2次翻堆后，這與本研究結(jié)果一致。在雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中，纖維素降解酶系中的各降解酶在培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，各自在特定發(fā)酵階段發(fā)揮降解作用，培養(yǎng)料中纖維素降解最快的時(shí)期Cx酶活力也處于峰值，表明Cx酶可能在纖維素的降解中起主導(dǎo)作用。木聚糖酶是培養(yǎng)料中半纖維素降解的主要酶。木質(zhì)素降解酶系中的各種酶變化規(guī)律一致，這3種酶在木質(zhì)素降解過(guò)程中存在較好的協(xié)同關(guān)系，共同作用從而完成各階段的木質(zhì)素降解。根據(jù)本研究結(jié)果，結(jié)合各種降解酶活性的變化規(guī)律，在雙孢蘑菇培養(yǎng)料隧道式發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)使培養(yǎng)料溫度盡快升高，從而使木質(zhì)纖維素的相關(guān)降解酶活性在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到峰值，這對(duì)于縮短培養(yǎng)料發(fā)酵時(shí)間，減少培養(yǎng)料中的物質(zhì)能量損耗具有重要作用。培養(yǎng)料發(fā)酵各階段酶活性變化特性的研究也為進(jìn)一步了解雙孢蘑菇培養(yǎng)料隧道式發(fā)酵中微生物對(duì)物質(zhì)的降解轉(zhuǎn)化規(guī)律及提高雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵的質(zhì)量等提供參考。

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Changes of extracellular degrading enzyme activity during the tunnel fermentation of Agaricus bisporus com post

ZHU Yan-hua，WANG Qian，SONG Xiao-xia，ZHANG Jin-jing，LIZheng-peng，CHEN Hui，HUANG Jian-chun*
（Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences；Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization（South），Ministry of Agriculture，P.R.China；National Engineering Research Center of Edible Fungi；National R＆D Center for Edible Fungi Processing；Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai，Shanghai201403，China）

The changes ofmain degrading enzyme activities in different stages of tunnel culture of Agaricus bisporus compost were studied.The results showed that the activities of different degrading enzymes showed different change rules.Cellulose degrading enzymes acted at different fermentation stages，and Cx enzyme activity reached the peak at the second turn，while the activities of C1 and BG enzymeswere the highest in the secondary materials and primarymaterials respectively.Hemicellulose degrading enzymes include xylanase and xylosidase.Xylanase activity increased firstand then decreased，and reached the highestat the second turn，while the activity of xylosidase was always low.The change trend of lignin degrading enzymes（Lac，MnP and LiP）were the same，and they all increased first，then decreased，then increased，and then decreased，and reached the peak at the second turn.Protease activity was the highest at the first turn，then decreased，and increased again in the secondarymaterials.Amylase activity was only higher at the beginning of fermentation，and then the enzyme activity was always low.Lignin in the culture medium degraded fastest at the first turn，while cellulose and hemicellulose degraded fastest at the second turn.

Agaricus bisporus；Culturematerial；Fermentation；Enzyme activity

2016-04-11

農(nóng)業(yè)部公益性（農(nóng)業(yè)）行業(yè)科研專項(xiàng)（201503137）；上海市科技興農(nóng)推廣項(xiàng)目 ［滬農(nóng)科推字（2014）第2-2號(hào)］；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目（15391900200）

朱燕華（1982—），女，博士，助理研究員，主要從事雙孢蘑菇栽培與生理研究。E-mail：zhuyanhua＠saas.sh.cn，Tel：021-62200538

*通信作者，E-mail：jianmushroom＠163.com

S646

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1000-3924（2017）06-006-05

閆其濤）