羥基喜樹(shù)堿對(duì)人肺癌A549細(xì)胞自噬的影響*

魏艷杰 ，彭子荷 ，李晨浩 ，郝帥林 ，張媛 ，李朝陽(yáng) ，肖童 ，郝小惠，劉和亮，田煒，王宏麗

（1.華北理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，河北 唐山 063210；2.河北省滄州中心醫(yī)院，河北滄州 061014；3.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063210）

羥基喜樹(shù)堿對(duì)人肺癌A549細(xì)胞自噬的影響*

魏艷杰1，彭子荷1，李晨浩2，郝帥林1，張媛1，李朝陽(yáng)1，肖童1，郝小惠1，劉和亮1，田煒1，王宏麗3

（1.華北理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，河北 唐山 063210；2.河北省滄州中心醫(yī)院，河北滄州 061014；3.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063210）

目的探究羥基喜樹(shù)堿（HCPT）對(duì)人肺癌A549細(xì)胞自噬的作用。方法體外進(jìn)行肺癌A549細(xì)胞的培養(yǎng)，分別使用50、200和400μmol的HCPT處理，利用MTT法檢測(cè)HCPT對(duì)細(xì)胞存活率的影響；共聚焦顯微鏡成像技術(shù)觀(guān)察HCPT對(duì)細(xì)胞自噬活性的影響；Western blot檢測(cè)HCPT對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3、p-mTOR表達(dá)的影響。結(jié)果HCPT抑制A549細(xì)胞的活性；HCPT處理24 h后細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核周?chē)鶦yto-ID綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；與對(duì)照組比較，HCPT治療各組LC3II/I值升高，p-mTOR表達(dá)減少；且加入自噬抑制劑6-氨基-3-甲基嘌呤（3-MA）處理后的各組與相對(duì)應(yīng)的HCPT治療各組比較，A549細(xì)胞的增殖抑制增強(qiáng)。結(jié)論HCPT能抑制A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生自噬；HCPT發(fā)揮抑制A549細(xì)胞增殖作用可能與自噬密切相關(guān)；抑制細(xì)胞自噬可能會(huì)增強(qiáng)HCPT的抗A549細(xì)胞增殖能力。

肺癌；自噬；羥基喜樹(shù)堿；3-MA；mTOR

近年來(lái)數(shù)據(jù)顯示，肺癌嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，全球范圍內(nèi)肺癌的發(fā)病率和死亡率增加[1]。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和環(huán)境污染的加劇，肺癌已成為各種癌癥死亡的首要原因[2]。在肺癌的治療方面，目前化療仍然是重要的輔助治療手段，但化療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞的耐藥性及其抗凋亡能力是妨礙多種腫瘤治愈的主要原因之一。近年來(lái)，細(xì)胞自噬與腫瘤之間的關(guān)系在腫瘤研究領(lǐng)域已成為熱點(diǎn)。最新研究顯示，自噬與腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移存在密切的關(guān)系，因此自噬有望成為腫瘤治療中新的靶點(diǎn)。

羥基喜樹(shù)堿（Hydroxycamptothecin，HCPT）是一種廣譜抗腫瘤藥物，但其抑制腫瘤細(xì)胞的具體機(jī)制尚不明確[3]。因此本研究擬通過(guò)觀(guān)察HCPT對(duì)人肺癌A549細(xì)胞自噬的影響，以期為其今后的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)

A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。A549細(xì)胞株在5% CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中，貼壁生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，0.25%胰酶消化傳代。

1.2 主要試劑與儀器

HCPT（純度＞99%）由百靈威科技有限公司提供，6-氨基-3-甲基嘌呤（3-MA）、雷帕霉素（RAPA）和兔源LC3B多克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒（MTT）為石家莊天舜生物科技有限公司產(chǎn)品，Cyto-ID Autophagy Detection Kit（ENZ-51031-K200）為美國(guó)Enzo life science產(chǎn)品。37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma公司），半干轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司），JY200C電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），激光共聚焦顯微鏡FV1000（日本Olympus公司）。

1.3 體外藥物敏感的MTT法檢測(cè)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且細(xì)胞狀態(tài)良好的細(xì)胞重復(fù)細(xì)胞培養(yǎng)步驟，用新培養(yǎng)基使細(xì)胞重懸混勻，在96孔板每孔中加入200μl含有大約3 000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁后，每孔加入不同劑量HCPT培養(yǎng)液200μl（對(duì)照組加普通培養(yǎng)液），HCPT+3-MA組在HCPT處理前1 h加3-MA（5 mmol）處理，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后每孔分別加入MTT（0.5%MTT）溶液20μl，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150μl，15 min后顯微鏡下觀(guān)察到藍(lán)色結(jié)晶物完全溶解，于570 nm波長(zhǎng)用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.4 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)自噬發(fā)生情況

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且細(xì)胞狀態(tài)良好的細(xì)胞，消化離心后置于共聚焦小皿內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)到50%～70%后，每皿加入不同濃度HCPT培養(yǎng)液2 ml（對(duì)照組用普通培養(yǎng)液）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組（RAPA組）。按CYTO-ID?Autophagy Detection Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)加入Hoechst 33342 Nuclear Stain、CYTO-ID?Green Detection Reagent 37℃避光孵育30 min，置于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。

1.5 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、p-mTOR表達(dá)

LC3在自噬過(guò)程中具有標(biāo)志性的作用，其在細(xì)胞內(nèi)有2種存在形式（LC3I、LC3II），自噬體的形成過(guò)程中伴隨著LC3I向LC3II的轉(zhuǎn)變。因此LC3II/LC3I值可以反映自噬發(fā)生情況。p-mTOR是細(xì)胞自噬的負(fù)性調(diào)控蛋白。重復(fù)細(xì)胞傳代步驟，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并充分混勻，每個(gè)小皿內(nèi)加入2 ml細(xì)胞懸液，培養(yǎng)過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（加入普通培養(yǎng)液）、HCPT組（50、200和 400μmol）、HCPT+3-MA組， 處 理24 h后收集細(xì)胞。通過(guò)裂解細(xì)胞、提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定后，運(yùn)用Western blot檢測(cè)LC3、p-mTOR的表達(dá)。用Image J進(jìn)行灰度掃描及定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均值比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析（One-way，ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCPT對(duì)A549細(xì)胞活性的影響

MTT法測(cè)定A549細(xì)胞的存活率，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=186.662，P=0.000），各組細(xì)胞的存活率有差別；進(jìn)一步兩兩比較顯示，與對(duì)照組比較，HCPT組（50、200和400μmol）中細(xì)胞相對(duì)存活率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.614、12.614和44.679，均P=0.000），見(jiàn)附表。表明HCPT劑量越大，其抑制A549細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)。

附表 不同劑量HCPT對(duì)A549細(xì)胞活性的影響 （n =10）

2.2 HCPT對(duì)細(xì)胞自噬的影響

2.2.1 細(xì)胞自噬結(jié)果 與對(duì)照組比較，HCPT組處理24 h后細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核周?chē)鶦yto-ID綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，與經(jīng)典的自噬誘導(dǎo)劑RAPA處理后情況相似，其中200μmol HCPT組Cyto-ID綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)尤為明顯，說(shuō)明HCPT可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬發(fā)生，且其誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬發(fā)生的能力與用藥劑量有關(guān)。見(jiàn)圖1。

2.2.2 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)結(jié)果 Western blot檢測(cè)各組LC3II/LC3I值的變化，LC3II/LC3I值在 對(duì) 照 組、50μmol HCPT組、200μmol HCPT組、400μmol HCPT 組表達(dá)為（100.0±2.12）、（107.07±0.94）%、（136.36±0.62）% 和（125.25±1.31）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=855.315，P=0.000），各組LC3II/LC3I值有差別；進(jìn)一步兩兩比較顯示，與對(duì)照組比較，HCPT組（50，200，400μmol）中LC3II/LC3I值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-6.625、-38.147和 -23.203， 均P=0.000）。200μmol HCPT組LC3II/LC3I值上升最為顯著。進(jìn)一步說(shuō)明，HCPT可誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，其誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬的能力與劑量有關(guān)。見(jiàn)圖2。

2.2.3 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p-mTOR的表達(dá)結(jié)果Western blot檢測(cè)各組p-mTOR水平的變化，p-mTOR在 對(duì) 照 組、50μmol、200μmol及 400μmol HCPT組 表 達(dá) 為（100.00±7.36）%、（95.61±7.41）%、（70.29±6.67）%及（49.53±5.42）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=716.920，P=0.000），各組p-mTOR水平有差別；進(jìn)一步兩兩比較顯示，與對(duì)照組比較，HCPT組（50、200和400μmol）p-mTOR水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.993、19.502和44.184，P=0.005、0.000和0.000），HCPT誘導(dǎo)A549的細(xì)胞自噬可能與m-TOR信號(hào)通路有關(guān)。見(jiàn)圖3。

圖1 不同濃度HCPT對(duì)A549細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用（共聚焦顯微鏡成像×40）

圖2 HCPT對(duì)A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)的影響

圖3 HCPT對(duì)A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p-mTOR表達(dá)的影響

2.3 HCPT聯(lián)合自噬抑制劑3-MA對(duì)肺癌A549細(xì)胞的影響

2.3.1 3-MA抑制HCPT誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬 Western blot檢測(cè)各組LC3II/LC3I值的變化，LC3II/LC3I值在200μmol HCPT組、200μmol HCPT+3-MA組、3-MA組及對(duì)照組表達(dá)為（158.22±3.26）%、（110.30±11.23）%、（107.57±15.86）% 和（100.00±8.02）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=37.222，P=0.000），各組LC3II/LC3I值有差別；進(jìn)一步兩兩比較顯示，3-MA組與對(duì)照組比較，LC3II/LC3I值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.924，P=0.200），200μmol HCPT組與對(duì)照組比較，LC3II/LC3I值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.204，P=0.000）；200μmol HCPT+3-MA 組 與200μmol HCPT組比較，LC3II/LC3I值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（t=11.243，P=0.000）；200μmol HCPT+3-MA組與3-MA組比較，LC3II/LC3I值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.344，P=0.372）。表明自噬抑制劑 3-MA（5 mmol）可以抑制HCPT誘導(dǎo)的自噬。見(jiàn)圖4。

2.3.2 抑制自噬后HCPT對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖抑制的影響 MTT法測(cè)定A549細(xì)胞的存活率，自噬抑制劑3-MA聯(lián)合HCPT（50、200和400μmol）處理24 h后，A549細(xì)胞的增殖抑制率分別為（30.7±4.3）%、（38.1±4.6）%和（42.9±1.1）%，高于單用HCPT同劑量組的（12.9±2.3）%、（21.6±4.1）% 和（32.7±2.1）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=140.801，P=0.000），各組細(xì)胞的存活率有差別；進(jìn)一步兩兩比較顯示，與相同劑量HCPT組比較，50、200和400μmol HCPT+3-MA組中細(xì)胞相對(duì)存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.401、15.771和6.476，均P=0.000），這提示HCPT聯(lián)合自噬抑制劑治療肺癌的效果可能更佳。見(jiàn)圖5。

圖4 3-MA（5 mmol）抑制200μmol HCPT誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬作用

圖5 3-MA抑制自噬后HCPT對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖抑制的影響

3 討論

無(wú)限增殖障礙是惡性腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征。大量藥物的抗腫瘤作用是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)的[4-5]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HCPT具有抑制A549細(xì)胞增殖的作用，且HCPT劑量越大抑制作用越強(qiáng)。這提示HCPT發(fā)揮抗腫瘤的作用可能與其抑制腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。

自噬是真核細(xì)胞通過(guò)溶酶體途徑降解和回收受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過(guò)程[6]。一些研究指出[7-8]，自噬可能在癌癥發(fā)展的不同階段發(fā)揮不同的作用，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)自噬途徑抵抗由環(huán)境變化所造成的損害，也可以通過(guò)自噬啟動(dòng)程序性死亡通路，發(fā)生自噬性死亡；自噬在不同的腫瘤中所發(fā)揮的作用也是不盡相同的。本研究重點(diǎn)探討了HCPT是否誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生自噬。研究結(jié)果顯示，經(jīng)HCPT處理后，A549細(xì)胞的LC3II/LC3I比值升高，自噬負(fù)性調(diào)控蛋白p-mTOR表達(dá)降低，結(jié)合激光共聚焦熒光染色法觀(guān)察結(jié)果，可以確定的是，HCPT可誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬。有研究指出，肺癌細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞以及結(jié)腸癌細(xì)胞等均具有較高的自噬潛能，這在其處于惡劣環(huán)境時(shí)有一定的保護(hù)作用[8-9]。在腫瘤進(jìn)行化療和放療的過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)通過(guò)提高自噬活性，快速降解并循環(huán)利用受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)，及時(shí)進(jìn)行受損DNA的修復(fù)，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，以維持其持續(xù)增殖[8]。另外，自噬也使一些抗腫瘤藥物的作用減弱：替莫唑胺作用于惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞3和7 d，細(xì)胞中自噬活性先增強(qiáng)后減弱，同時(shí)觀(guān)察到細(xì)胞的增殖先受到抑制后出現(xiàn)增殖現(xiàn)象[10]。有研究表明[8，11]，促進(jìn)自噬的藥物有抗腫瘤作用，因此靶向促進(jìn)自噬的藥物在今后的腫瘤治療將會(huì)得到重視。目前雷帕霉素作為自噬誘導(dǎo)劑用于腫瘤治療的臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)開(kāi)始，研究證明其具有抑制多種腫瘤細(xì)胞的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)[8，12]苦參堿和盼生安分別作用于HepG2細(xì)胞和肝癌BEL-7402細(xì)胞時(shí)均有自噬的參與。這些藥物不僅可以激發(fā)腫瘤細(xì)胞的自噬，同時(shí)也參與了自噬分子的調(diào)控。多種自噬抑制劑可以加強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤作用。如抗瘧疾藥物氯喹聯(lián)合化療中的應(yīng)用，氯喹可以通過(guò)改變?nèi)苊阁w內(nèi)的酸性環(huán)境進(jìn)而達(dá)到抑制細(xì)胞自噬發(fā)生的目的，從而促進(jìn)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力[8，13]。有研究[8，14]表明曲古抑菌肽（TSA）和伏立諾他（SAHA）發(fā)揮抗腫瘤的作用是通過(guò)抑制自噬達(dá)到的。此外，有研究表[8，15]明自噬抑制劑如3-MA、渥曼青霉素等多種自噬抑制劑在腫瘤的治療中都有可能扮演重要角色。由此看來(lái)，特定情況下細(xì)胞自噬具有保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用，防止其死亡。這提示抑制細(xì)胞自噬也可能作為某些腫瘤的治療的途徑。本研究也發(fā)現(xiàn)，HCPT聯(lián)合3-MA比單用HCPT對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用更強(qiáng)，由此推測(cè)HCPT在治療肺癌過(guò)程中，聯(lián)合自噬抑制劑可能會(huì)使治療效果更佳。

總之，本研究在體外探討了廣譜抗瘤藥物HCPT對(duì)肺癌A549細(xì)胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)HCPT對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量依賴(lài)性；HCPT誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可能與mTOR信號(hào)通路有關(guān)；HCPT聯(lián)合自噬抑制劑3-MA發(fā)揮的抗細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)。其具體機(jī)制有待于今后進(jìn)一步的探討。

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Effect of hydroxycamptothecin on autophagy of A549 lung cancer cells*

Yan-jie Wei1, Zi-he Peng1, Chen-hao Li2, Shuai-lin Hao1, Yuan Zhang1, Zhao-yang Li1,Tong Xiao1, Xiao-hui Hao1, He-liang Liu1, Wei Tian1, Hong-li Wang3
(1. Medical Research Center, North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063210, China; 2. Department of Oncology, Cangzhou Central Hospital, Cangzhou,Hebei 061014, China; 3. Public Health School, North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063210, China)

ObjectiveTo investigate whether autophagy is involved in the anticancer mechanisms of hydroxycamptothecin (HCPT) in human lung cancer A549 cellsin vitro.MethodsHuman non-small cell lung cancer cell line A549 was cultured. In our study, cell viability was assessed by MTT assay, Cyto-ID staining was used for autophagy detection which was observed by laser scanning confocal microscope (LSCM), the expression of LC3II/I and p-mTOR were measured by Western blot.ResultsHCPT (50, 200 and 400 μmol) suppressed the viability of A549 cells in a concentration-dependent manner. Moreover, HCPT increased autophagy level in the A549 cells. The autophagy inhibitor 3-MA caused a statistically significant increase in growth inhibition of the HCPT-treated A549 cells.ConclusionsHCPT induces autophagy in lung cancer A549 cellsin vitro. HCPT (50, 200 and 400 μmol) suppresses the viability of A549 cells in a concentration-dependent manner and its induction of cell autophagy is related to the dosage. Autophagy inhibition combined with HCPT may be a better way for the treatment of lung cancer.

lung cancer; autophagy; HCPT; 3-MA; mTOR

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.006

1005-8982（2018）01-0025-05

2017-02-10

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（No：ZD2017063）；唐山市國(guó)際科技合作項(xiàng)目（No：14160201B）；2016年地方高校國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（No：201610081026）；華北理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)踐計(jì)劃項(xiàng)目（No：X2016026）

王宏麗，E-mail：tsruoshui@163.com

R734.2

A

（張蕾 編輯）