肉鴨消化道酵母益生菌酸脅迫耐受性及其機理研究

劉 瓊， 胡先勤*， 胡駿鵬， 王學東，廖漢江， 段勝浩， 鄭紅生

（1.武漢輕工大學，湖北武漢 430023；2.宜昌安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；3.武漢永生鴨業(yè)有限公司，湖北武漢 430077）

肉鴨消化道酵母益生菌酸脅迫耐受性及其機理研究

劉 瓊1， 胡先勤1*， 胡駿鵬2， 王學東1，廖漢江2， 段勝浩1， 鄭紅生3

（1.武漢輕工大學，湖北武漢 430023；2.宜昌安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；3.武漢永生鴨業(yè)有限公司，湖北武漢 430077）

從肉鴨消化道內(nèi)分離出的7株釀酒酵母益生菌中，篩選出高耐酸性的菌株，并探究酵母細胞內(nèi)Na+、K+濃度及H+-ATPase活性與環(huán)境pH的相關(guān)性。結(jié)果顯示：不同酵母菌株酸脅迫耐受性存在差異。酵母菌株通過泵出H+吸收K+來維持胞內(nèi)pH穩(wěn)定，表明膜H+-ATPase和K+在酵母菌株耐酸中發(fā)揮作用。7株釀酒酵母細胞膜H+-ATPase活性與其生長環(huán)境的pH呈負相關(guān)。Y-2和Y-7兩株酵母菌株相對于其他菌株耐酸性更佳，可作為后續(xù)肉鴨專用飼用酵母益生菌的備選菌株。

肉鴨；酵母菌；酸脅迫耐受性；H+-ATPase

This experiment aimed to screen low pH resistant strains from 7 Saccharomyces cerevisiaes which separated from the digestive tract of the meat duck.Moreover，the relationship between the Na+，K+concentration，the activity of H+-ATPase and the pH of yeast cells were explored.The results showed that the ability of acid tolerance of different strains was variance.The S.cerevisiae strains could maintain a neutral cytoplasmic pH by pumping H+and absorbing K+，which proved the function of H+-ATPase and K+in its acidic tolerance.The H+-ATPase activity showed a negative correlation with the growth pH of 7 S.cerevisiae strains.The tolerance to low pH of test strains Y-2 and Y-7 were better than others，which could be used as a follow-up for alternative special probiotic candidate fodder yeast strains for duck.

meat duck；yeast；acid stress tolerance；H+-ATPase

近年來，益生菌作為抗生素的替代品及其優(yōu)勢引起了業(yè)界的廣泛關(guān)注。與抗生素相比，益生菌具備天然、無副作用和無污染等優(yōu)點，但其飼用效果還不夠穩(wěn)定，從優(yōu)選菌株角度改善其應用效果顯得十分迫切。酵母菌在動物體內(nèi)作為益生菌的應用廣泛，其作為益生菌應用于動物飼料中，可減少抗生素使用帶來的弊端，有效降低原料中粗纖維，提高蛋白質(zhì)等營養(yǎng)組分的含量 （Sekler等，1993；Patrizia 等，1981），并且可預防、治療動物腸道紊亂等疾病，從而改善動物消化道環(huán)境。動物消化道的低pH對益生菌有潛在的滅活作用，抵御不良環(huán)境的同時，保證足夠的活菌數(shù)是益生菌在動物腸道內(nèi)發(fā)揮益生作用的前提 （成妮妮等，2004）。作為優(yōu)良酵母益生菌的備選菌株，其必須可耐受對其不利的動物消化道高酸性環(huán)境 （張秋華等，2010；辛亞平等，2010）。一般微生物在生長繁殖時胞質(zhì)pH在中性左右，如Spermatosopis acidophila在pH 1.0時生長最適，但胞內(nèi)pH仍維持在中性 （張秋華等，2010）。對極端嗜酸的Dunaliella acidophila研究發(fā)現(xiàn)，K+能促進H+-ATPase的活性，作用部位為細胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)（辛亞平等，2010）。H+-ATPase在酵母細胞中起堿化胞質(zhì)的作用，對細胞內(nèi)pH的調(diào)控起到關(guān)鍵作用，環(huán)境pH對該酶的表達量有一定影響（Mason等，1998；Foster等，1995；Serrano 等，1986）。 本試驗旨在從肉鴨消化道內(nèi)分離出的7株釀酒酵母中，通過pH應激處理選取耐低pH最佳的高抗性菌株，并探究低pH與酵母菌株胞內(nèi)Na+、K+金屬離子濃度及細胞膜H+-ATPase活性的相關(guān)性，為開發(fā)高抗性、專一型的酵母益生菌制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 本實驗室從肉鴨腸道分離保存的7株釀酒酵母（張霞等，2015）。

1.1.2 培養(yǎng)基 瓊脂培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基均為國產(chǎn)。

1.1.3 試劑 GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 （Genmed Scientifics INC.U.S.A），GENMED酵母氫ATP酶（H+-ATPase）活性酶連續(xù)反應光譜法定量檢測試劑盒 （Genmed Scientifics INC.U.S.A），鈉標準溶液、鉀標準溶液、硝酸、氯化銫、乳酸等均為國產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌的培養(yǎng) 將7株釀酒酵母分別接種于YPD培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min 2次培養(yǎng) （以獲得第二代酵母細胞）至對數(shù)期（107～108個/mL）。

1.2.2 酵母菌酸脅迫耐受性 取適量制備好的菌懸液，在600 nm波長處用液體YPD培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其 OD 值為 0.6（Garcíahernández等，2012），備用，在滅好菌的液體YPD培養(yǎng)基中加入適量乳酸（85.0% ～90.0%）， 調(diào)節(jié)其 pH分別為 2.0、3.0、4.0、5.5（空白組），分別取 1 mL調(diào)節(jié)好濃度的菌液接種于不同pH液體YPD培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，24 h后，梯度稀釋菌液，固體YPD涂布，計數(shù)（cfu/mL），計算其存活率，平行3組。酵母菌存活率（S）的計算公式為：

S/%=（cfu/mL）YPD+乳酸/（cfu/mL)YPD×100。

1.2.3 酵母培養(yǎng)液中Na+、K+濃度測定 取制備好的釀酒酵母發(fā)酵液5 mL，3000 r/min離心10 min，取上清液再用定量濾紙過濾后（約為4 mL)，作為原樣品液低溫貯存。加熱消化，直至無色透明為止。加入適量水加熱去除多余的硝酸。待燒杯液體接近2～3 mL時，冷卻，用去離子水洗并轉(zhuǎn)移到10 mL刻度試管中，加水定容至刻度。取適量質(zhì)量濃度為1000 mg/L的Na+、K+標準儲備液，配制標準系列使用液，濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/mL。將消化樣液、試劑空白液、標準稀釋液分別導入火焰，測其發(fā)射強度。樣品中元素含量計算公式為：

式中：x為試樣中元素的含量，mg/100g；c為測定用試樣液中元素的濃度，μg/mL；c0為試劑空白液中元素的濃度，μg/mL；V為試樣液定容體積，mL；f為試樣液稀釋倍數(shù)；m為試樣的質(zhì)量，g。

1.2.4 酵母菌細胞H+-ATPase活性測定 使用GENMED酵母氫 ATP酶（H+-ATPase）活性酶連續(xù)反應光譜法定量檢測試劑盒進行測定。取10 mL待測的新鮮真菌/酵母細胞（OD600=0.4～0.8），移入到預冷的15 mL錐形離心管中，置于冰槽里5 min，離心（1000 g，4 ℃，5 min），抽去上清液，加入250μL GENMED裂解液，充分混勻，移入預冷的1.5 mL離心管中，加入100 mg GENMED強化液，強力渦旋振蕩15 s，置于冰槽里1 min（重復五次），加入250μL GENMED裂解液，充分混勻，離心（16000 g，4 ℃，15 min），移取 500 μL 上清液到新的預冷的1.5 mL離心管，移取10μL進行蛋白質(zhì)定量檢測（使用GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-MS30030.1）。移取730μL GENMED緩沖液到新的比色皿，加入20μL GENMED酶促液，100μL GENMED反應液，100μL GENMED底物液，放進28℃培養(yǎng)箱里靜置3 min，加入50μL待測樣品，混勻，即刻放進分光光度儀檢測：340 nm讀數(shù)0～30 min。酶活計算公式為：

式中：A為樣品活性，mg；r1為樣品讀數(shù)；r0為背景讀數(shù)；x為樣品稀釋倍數(shù)；6.22為毫摩爾吸光系數(shù)；t為反應時間，min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH環(huán)境培養(yǎng)酵母菌存活率 通過低pH沖擊試驗，采用平板涂布計算釀酒酵母在不同pH環(huán)境的存活率。由表1可知，7株釀酒酵母均可在低酸性環(huán)境中生長，且在不同pH環(huán)境中的存活率隨pH下降而降低。其中，Y-2和Y-7兩株釀酒酵母菌株在較低pH環(huán)境中的存活率均高于其余5株。由此可知，釀酒酵母培養(yǎng)環(huán)境pH對酵母生長有顯著影響，且不同酵母菌株對環(huán)境酸脅迫耐受性有顯著差異。

表1 不同pH環(huán)境中菌株的存活率%

2.2 酵母培養(yǎng)液中Na+、K+濃度 從圖1和圖2中可以看出，7株釀酒酵母培養(yǎng)液中，Na+、K+濃度均隨pH的降低而降低，由此可知，高酸性的外界生長環(huán)境對酵母菌胞內(nèi)環(huán)境有一定影響。在酵母如何維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的機理研究中提到最多的是質(zhì)子泵和Na+-K+泵，有研究認為，酵母在高酸性環(huán)境中生長時，其細胞可通過將胞內(nèi)H+排出，吸收環(huán)境中的K+來維持胞內(nèi)pH穩(wěn)定。酵母處于高酸性環(huán)境中時，酵母細胞膜上的Na+-K+泵即ATPase的大亞基以親Na+態(tài)與Na+結(jié)合，水解ATP釋放能量，改變酵母細胞膜電位，使膜內(nèi)電位負值增大，釋放的能量可將Na+運輸?shù)郊毎?，同時從外界環(huán)境將K+運輸?shù)郊毎麅?nèi)，維持酵母細胞內(nèi)離子平衡。Na+濃度的降低可能是由于酵母細胞處于高酸性環(huán)境中時活菌數(shù)減少導致其從胞內(nèi)釋放到環(huán)境中的Na+減少。K+濃度的降低表明酵母在處于高酸性環(huán)境中時確實有大量K+進入細胞，維持胞內(nèi)酸堿環(huán)境的穩(wěn)定，從而使得酵母細胞可以在高酸性的惡劣環(huán)境中存活。7株釀酒酵母中，Y-2和Y-7釀酒酵母菌培養(yǎng)液中Na+濃度均高于其余幾株釀酒酵母菌培養(yǎng)液中Na+濃度，而K+濃度均低于其余幾株，Y-2和Y-7菌株在高酸性環(huán)境中，運輸Na+、K+的能力較其余幾株菌株強，因此推斷，Y-2和Y-7菌株的酸脅迫耐受性相對其他菌株更佳。

圖1 7株酵母在不同p H環(huán)境培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)液中Na+濃度

圖2 7株酵母在不同pH環(huán)境培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)液中K+濃度

2.3 菌株低pH處理后H+-ATPase活性 酵母細胞膜的H+-ATPase可通過消耗ATP形式的能量，在酵母細胞膜內(nèi)外建立起跨膜的質(zhì)子電化學勢梯度，從而為各種離子及小分子物質(zhì)進行跨膜運輸提供足夠的動力，保證酵母細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。從表2進行分析，結(jié)果表明7株釀酒酵母細胞膜的H+-ATPas活性均與其生長環(huán)境的pH呈負相關(guān)，pH 2.0時酶的活性最高，pH 5.5時則最低。由此可知，不同釀酒酵母菌株胞膜的H+-ATPas表達量存在差異，且7株釀酒酵母中，酵母菌株Y-2和Y-7酶活力高于其他幾株。故推斷該酵母菌株可在高酸性環(huán)境生長，其細胞膜H+-ATPase發(fā)揮了重要作用。H+-ATPase反應的最適的pH為6.0左右，因此推斷，酵母細胞膜的H+-ATPase活力隨環(huán)境pH的降低而增高的原因是其在較低pH環(huán)境下酶表達量有所增加導致的，即釀酒酵母在處于低pH環(huán)境中時會促使其H+-ATPase表達量增加（張國順等，2004）。

表2 7株酵母在不同pH環(huán)境培養(yǎng)24 h后細胞H+-ATPase活性mmol/mg

3 討論

酵母菌經(jīng)過長期衍變得到了在復雜條件下較為迅速適應外界環(huán)境的應激能力 （Arthur等，1976），處于溫和環(huán)境中能較為快速的進行繁殖，在惡劣的環(huán)境中能夠完成基本的生存，低pH對大多數(shù)生物有毒害作用。本試驗對肉鴨消化道分離出的7株釀酒酵母進行低pH沖擊試驗，考察了7株肉鴨原酵母菌株的酸脅迫耐受性，并對其耐酸機理進行了初步探討。7株釀酒酵母均可在較低pH環(huán)境中生長，但不同酵母菌株對環(huán)境酸脅迫耐受性表現(xiàn)出顯著差異，供試7株釀酒酵母菌株中，Y-2和Y-7兩株菌株表現(xiàn)出較強的耐酸性。

目前報道較多的是細菌的耐酸機理，如質(zhì)子泵、大分子的保護和修飾、細胞膜組分的變化、胞內(nèi)堿性物質(zhì)的產(chǎn)生、細胞濃度、代謝途徑的改變和其他調(diào)節(jié)因子對耐酸都有作用 （Argyri等，2013；Cotter等，2003）。 本試驗針對酵母細胞內(nèi)Na+、K+濃度變化和膜H+-ATPase活性進行分析。7株釀酒酵母中Y-2和Y-7兩株菌株細胞內(nèi)Na+、K+濃度和膜H+-ATPase活性變化均與其存活率結(jié)果一致。

4 結(jié)論

肉鴨消化道酵母菌株的酸脅迫耐受性存在差異，不同菌株的耐酸性與酵母細胞內(nèi)Na+、K+濃度變化及細胞膜H+-ATPase活性有密切關(guān)系。本研究中Y-2和Y-7酵母菌株的酸脅迫耐受性最佳。

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S816.7

A

1004-3314（2017）24-0035-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172408

武漢市應用基礎(chǔ)研究計劃（2014020101010073）；武漢輕工大學大學生科研項目（xsky2016001）

*通訊作者