Morris水迷宮檢測動物學習記憶水平的方法學

周嬌嬌 闕建宇 于雯雯 陳默雷 吳梓琪 邱麗萍 朱坤杰

(齊齊哈爾醫(yī)學院機能實驗教學中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

Morris水迷宮檢測動物學習記憶水平的方法學

周嬌嬌 闕建宇 于雯雯 陳默雷 吳梓琪 邱麗萍 朱坤杰

(齊齊哈爾醫(yī)學院機能實驗教學中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

Morris水迷宮；實驗方法

阿爾茨海默病(AD)是現(xiàn)代醫(yī)學的治療難點，也是老年醫(yī)學研究的熱點。是目前神經(jīng)生物學和神經(jīng)藥理學非常重要的研究內(nèi)容。Morris 水迷宮〔1〕1981年初被設計并應用于學習記憶腦機制研究，目前已成為AD基礎研究中評價動物學習記憶的經(jīng)典方法。然而在國內(nèi)外現(xiàn)有文獻中，關于Morris 水迷宮實驗動物的選擇、實驗指標確定、數(shù)據(jù)統(tǒng)計等方面存在很大差異，這可能造成資源的浪費和實驗成本的增高，導致實驗結果和結論的偏差。研究對Morris 水迷宮方法中動物選擇、觀察指標確定、實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法、實驗設備和環(huán)境、相關實驗操作等問題進行對比觀察，對方法中存在的問題給予規(guī)范和說明，為AD的基礎研究及神經(jīng)生物學和神經(jīng)藥理學研究中獲得有效準確的Morris水迷宮實驗數(shù)據(jù)資料，進而獲得關于動物學習記憶水平的客觀評價提供參考。

1 設備與環(huán)境

1.1實驗設備 Morris水迷宮由圓形的水池、可移動位置并隱藏在水面下的平臺、圖像自動采集處理系統(tǒng)組成。國內(nèi)文獻報道，水迷宮水池直徑大鼠多為160～180 cm，小鼠為100～120 cm，高度均為50 cm〔2〕。平臺直徑大鼠12 cm，小鼠6 cm，高度30 cm，表面粗糙；國外文獻所用水迷宮水池直徑大鼠為180～200 cm，小鼠為100～150 cm，高60 cm，平臺直徑大鼠為10 cm，小鼠5 cm，高度30 cm〔3〕。訓練強度相同的情況下，水池的大小是動物學習記憶的重要因素。過小的水池使動物爬上平臺的偶然性增加，任務難度減小。過大的水池則會增加游泳路徑，體力消耗過大，爬上站臺的概率減少。推薦水池大小：大鼠180 cm，小鼠120 cm。水池劃分為東南西北4個象限(東北NE，東南SE，西南SW，西北NW),象限池壁圓弧中點為可選的動物入水點，平臺可放在任意一個象限內(nèi)(多見SW象限)。圖像采集分析系統(tǒng)記錄動物游泳軌跡數(shù)據(jù)用于指標的提取及分析〔4〕。

1.2實驗環(huán)境 這里包括試驗設備所處的環(huán)境和實驗動物游泳環(huán)境。一般Morris水迷宮硬件設備應固定放置在有水源、光線均一、安靜的環(huán)境，這樣可減少外界環(huán)境干擾所引起的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。

動物完成Morris實驗需要一定的水溫、光源及外界固定的參照物。水溫要求恒定，大鼠的水溫控制在(25±1)℃；小鼠的水溫則一般在21℃～22℃最宜，國外的文獻報道溫度在19℃～22℃范圍時大鼠的游泳狀態(tài)最佳〔3〕。水溫對實驗結果的影響很大，水溫過低會導致動物體力消耗過大，使其游泳成績變差或出現(xiàn)應激反應，如出現(xiàn)腹瀉，抽搐等；而水溫過高，Morris水迷宮水池則成為天然“浴盆”，動物出現(xiàn)漂浮不動的現(xiàn)象。實驗環(huán)境的光源保證水池水面上的光線要均一，避免光線在水面上形成有鋒利轉角折線，從而干擾動物游泳軌跡，見圖1。保證光線均一的方法是在水池周圍安放布簾或照明燈，新型的水迷宮設備在這方面已經(jīng)進行了周密的設計。水中加入牛奶或者無毒染料及黑色背景的布置都是為了視頻追蹤的需要。黑色背景建議使用。

參照物包括實驗室的設備、儀器、工作臺、桌椅、門窗和燈具等陳設和實驗操作人員，這些都可能被實驗動物看見并成為參照物為動物提供空間參考，被稱為迷宮外暗示。這些參照物如果變動會影響實驗結果，因此，實驗中要保持這些參照物的前后始終一致，特別是實驗操作人員所處的位置。

圖1 光線折射所致的偽跡(折線部分)

2 實驗操作及注意事項

Morris水迷宮用來檢測動物的空間學習記憶能力，經(jīng)典的實驗操作包括定位航行、空間探索，這是最常被選用做動物學習記憶評價的基本步驟；動物休息若干天后，可用同樣的方法進行定位航行和空間探索測試，來判定動物空間記憶的保持和再現(xiàn)能力；空間搜索試驗后24 h將站臺移至對位象限，進行對位訓練和對位探索試驗，也稱附加實驗，可以考察動物的工作記憶。

2.1操作方法

2.1.1定位航行實驗 也稱獲得性訓練。動物先移入實驗環(huán)境適應1 w，實驗第1天將鼠放入水池中自由游泳60～120 s以適應環(huán)境，為了避免時間過長消耗過多體力，一般小鼠60 s，大鼠120 s。第2天起將平臺置于某一象限，進行獲得性訓練，每日4次，4個不同的象限各一次，面向池壁將動物放入水中，Nature Protocols推薦每次實驗間隔時間15 s〔3〕，共訓練4～5 d，實驗觀察發(fā)現(xiàn)，定位航行實驗可根據(jù)動物狀態(tài)確定每天游泳次數(shù)，游泳次數(shù)過多會消耗動物體力導致數(shù)據(jù)失真。動物找到平臺后一般在平臺上休息10～15 s，若規(guī)定時間內(nèi)找不到平臺，則由操作者將其引導上平臺，在平臺上休息相同時間，再進行下一次實驗。若動物未充分休息再次跳入水中則需將其重新放回站臺重新計時。

2.1.2空間探索實驗 定位航行實驗結束24 h后，撤除水下平臺，任選1個入水點將動物面向池壁放入水中，所有動物必須在同一入水點，記錄動物在規(guī)定的時間內(nèi)(一般為60 s)第一次跨越平臺時間、跨越平臺次數(shù)等指標。

2.1.3附加實驗 包括反向空間實驗和二次反向空間加縮小平臺實驗，將平臺放在與原先平臺呈180°的位置進行獲得性訓練，24 h后進行空間探索實驗，稱反向空間實驗。再次將平臺放回原來象限并縮小平臺重復上述實驗(平臺面積可縮小至5 cm)，稱二次反向空間加縮小平臺實驗。這些實驗增加了實驗難度，用于考察動物的再學習能力、學習記憶的精準度或者工作記憶。近年來國外該項實驗做的相對較多，國內(nèi)還很少做〔4〕。

2.2操作中注意事項

2.2.1時間的控制 定位航行的天數(shù)一般控制在4～5 d，特別學習記憶障礙的年老體弱動物時間控制更重要，體能過度消耗會給實驗結果帶來的誤差。每次訓練的時間以60 s為宜。有資料顯示，60 s找不到平臺的大鼠，延長時間也很難找到，且時間過長會消耗動物更多體力〔5〕?？臻g搜索一般為1 d，將動物置于水池中搜索60 s，這樣的過程可以重復一次。此外，每天測試時間一致可消除不同時間動物反應性差異引起的數(shù)據(jù)波動。

2.2.2平臺設定及定標 平臺一般放置在第三象限(SW)，位置盡量遠離池壁邊緣，避免鼠環(huán)繞池壁游泳觸及，導致非記憶性上臺。大鼠游動致水面波動常使平臺移動，平臺移位可致大鼠上臺卻無法自動停止數(shù)據(jù)采集，所以注意保持平臺位置固定。目標區(qū)域定標要用和鼠顏色相近物體定標，定標物應將整個平臺覆蓋，否則也會出現(xiàn)鼠上臺數(shù)據(jù)采集無法停止，從而影響實驗數(shù)據(jù)的準確性。

2.2.3實驗動物選擇 不是所有鼠都適合水迷宮實驗，小鼠中KM、SAM小鼠由于基因庫大，雜交率高，個體差異大，存在不上臺或引導上臺后再次入水的情況。近交系BALB/C小鼠幾乎不能學會游泳，因而不能用于水迷宮，ICR小鼠、SD大鼠和Wistar大鼠是常用于水迷宮的實驗動物，而且雄性多于雌性〔6～8〕。此外，一次實驗動物的性別、體重、品系、周齡等應保持一致，以減少數(shù)據(jù)的偏差。

2.2.4控制實驗應激 控制實驗條件的一致性即可有效控制實驗應激。在動物體重、品系、周齡等一致的前提下，保持水池溫度均一，建立實驗操作人員和動物的熟識度，保持實驗室環(huán)境及其物品陳設不變，可有效控制實驗動物的應激。保持安靜的實驗環(huán)境，保持操作人員的體味不變也需要關注。

對于需要實驗前給藥，建議給藥操作和水迷宮操作者一致，這樣也可以很好地建立實驗操作者和動物的熟識度，減輕操作引起的應激。懸尾可顯著影響鼠的空間學習及記憶能力，從水中取鼠操作中，懸尾還可能導致水搶入呼吸道引起應激。實驗中要避免鼠的懸尾狀態(tài)。

2.2.5其他 實驗中光線要保持均勻可以消除偽跡，見圖1。新型的水迷宮設備水池四周裝一黑色、淺藍色或者白色的遮光簾，這樣即可以將光的影子擋住，又可以減少外界空間參照物不確定性對實驗結果產(chǎn)生的影響。水迷宮實驗對衰老引起的記憶減弱敏感，但用老年鼠進行實驗時，應確認衰老鼠的游泳能力降低不影響實驗結果。

3 實驗數(shù)據(jù)及統(tǒng)計處理

Morris水迷宮實驗的數(shù)據(jù)眾多，如何選擇有意義的指標作為評價動物學習記憶水平變化的依據(jù)，是實驗獲得正確可靠結論的前提。選擇恰當?shù)慕y(tǒng)計方法對數(shù)據(jù)進行處理則為實驗結論的獲得提供佐證。

3.1水迷宮實驗指標及意義 Morris水迷宮實驗的指標包括：持續(xù)時間(潛伏期)、總路程、平均速度、四個象限的時間和路程、初始角、外環(huán)區(qū)域路程、中環(huán)區(qū)域路程、中心區(qū)域路程、第一次穿越平臺時間及穿越次數(shù)、搜索策略等。每個指標的意義各不相同。

3.1.1潛伏期和總路程 潛伏期是Morris 水迷宮定位航行階段的重要指標，是動物每一次入水后第一次成功找到平臺所需的時間。它的長短也代表著動物空間學習記憶能力的好壞，潛伏期短，預示著動物的學習記憶能力好。潛伏期和動物游泳速度也有關，若正常大鼠游泳速度慢，潛伏期會比癡呆組動物長而影響結果。某些動物放入水中后會左右觀望打圈，或者原地不動確定方向后直接游到臺上，觀察到這種現(xiàn)象，說明動物記憶力好，也有動物原地不動致潛伏期延長，因此，實驗中應注意觀察動物的游泳狀態(tài)，以便綜合判定實驗數(shù)據(jù)。

潛伏期也是空間搜索實驗的第一次跨越平臺時間?？偮烦淌莿游锏谝淮紊吓_前總的運行路程，和潛伏期同樣是重要的評價指標?？蓡为殤没蛞云脚_象限路程/總路程作為評價動物學習記憶的指標。

3.1.2四個象限時間和路程 平臺所在象限的時間和路程是評價動物學習能力的指標，動物在這個象限活動的時間和路程越長，反映了動物的空間記憶能力比較好。平臺象限時間/潛伏期或平臺象限時間/第一次跨越平臺時間、平臺象限路程/總路程也是較好的評價動物學習記憶的指標。其他僅作為參考。

3.1.3外環(huán)區(qū)、中環(huán)區(qū)、中心區(qū)路程 嚙齒類動物游泳有繞邊性或邊緣性，站臺遠離周邊靠近水池中心，如果動物改變了游泳路線，在水池中心區(qū)域內(nèi)活動的路程長的話，反映其空間記憶能力好，反之則說明空間記憶力差。有些系統(tǒng)則同時給出不同區(qū)的時間和路程，各區(qū)時間和路程與總時間或總路程的比值可作為定位航行和空間搜索階段的共同指標。

3.1.4穿越平臺次數(shù) 是空間搜索實驗的重要指標，即在撤去平臺后，在一定的時間內(nèi)，實驗動物穿越原站臺位置的次數(shù)。動物穿越原站臺位置的次數(shù)越多，說明其空間學習記憶能力越好。平臺較小或者水池較大的時候，計算機有時亦會發(fā)生漏計的情況，因此實驗中也要注意觀察。

3.1.5初始角-弧度 指在將實驗動物放入水池后，動物的運動軌跡的起始點的切線與起始點和站臺中心連線之間的夾角；如果初始角的角度越小，說明動物記得站臺的位置，直接向站臺方向游，反映空間學習記憶能力比較好。但該指標和學習記憶的相關度較弱〔3〕。

3.1.6搜索策略 大鼠尋找平臺的方式大致可分為四種：邊緣式、隨機式、趨向式及直線式，見圖2。不同的搜索方式代表大鼠以不同的策略尋找平臺，正常動物的搜索策略隨著訓練次數(shù)的增加而呈現(xiàn)“邊緣式→隨機式→趨向式→直線式”的變化規(guī)律。癡呆動物的搜索策略會發(fā)生異常變化。比如只有邊緣式→隨機式，或者隨機式→邊緣式，趨向式和直線式比較少見。

圖2 不同Morris水迷宮搜索策略

3.2實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理 Morris 水迷宮實驗的指標眾多，目前國內(nèi)采用最多的是定位航行實驗的潛伏期、總路程和空間探索實驗的穿越平臺次數(shù)、平臺象限路程/總路程、平臺象限時間/總時間〔9〕。有資料顯示平臺象限路程/總路程、原平臺象限時間/總時間、總路程更可靠〔3〕。

有研究者認為每天第一次入水的結果更能顯示組間差異〔10〕,或者以訓練后幾天數(shù)據(jù)的平均數(shù)進行統(tǒng)計?；谙嚓P研究，我們認為對于獲得性訓練階段的數(shù)據(jù)，我們可以計算每只動物經(jīng)過一段時間學習后某一天或幾天數(shù)據(jù)均數(shù)，甚至可以計算每只鼠學習階段的全部數(shù)據(jù)的均數(shù)，然后進行組間比較，這樣要比單獨某一次的數(shù)據(jù)更能反映動物總體學習情況和學習成績。

關于統(tǒng)計方法，閆盼盼等〔11〕認為Morris水迷宮實驗屬重復測量設計,獲得的數(shù)據(jù)受動物組別、檢測時間點等多個效應因子影響，同一受試動物不同時間點所測得的數(shù)據(jù)存在高度的自相關性，且存在截尾數(shù)據(jù)(最大潛伏期)。因此，對Morris 水迷宮中各種數(shù)據(jù)應采用重復測量數(shù)據(jù)的多因素方差分析結合截尾數(shù)據(jù)的生存分析方法較為恰當〔5〕。我們的認為，Morris水迷宮獲得的數(shù)據(jù)雖然屬于重復測量數(shù)據(jù)，涵蓋時間、處理因素以及處理因素和時間的交互效應的影響，但在實驗設計和操作中進行組間非處理因素的均衡，當分析目的僅針對結局或某個時間點的組間效應比較時，而不是考慮不同組間的時間點連續(xù)變化趨勢差異，可以對點數(shù)據(jù)(某天或某次)或者學習階段每只鼠全程數(shù)據(jù)平均值(作為最終學習成績)，進行組間單因素方差分析比較，和采用重復測量數(shù)據(jù)的多因素方差分析得出的結論一致。

4 小 結

目前國內(nèi)Morris 水迷宮實驗方法的差異和不確定可能造成某些實驗結果失真，使實驗質(zhì)量和實驗效率降低。定位航行和空間搜索兩個階段是Morris水迷宮的經(jīng)典方法，應嚴格遵循操作程序及注意事項。附加實驗一般難度增加，是否進行取決于實驗目的，難度增加的任務對動物輕微認知障礙的檢測更為敏感。需要更精確檢測動物認知功能時可以選擇。實驗動物經(jīng)過一段時間的學習后，其學習成績會穩(wěn)定在某一水平，因此，學習的時間延長不會提高實驗質(zhì)量和效率，反而會加重實驗負擔。關于指標選擇上更多建議多個指標聯(lián)合使用，以免指標過于單一造成實驗偏差。而一份好的實驗數(shù)據(jù)對統(tǒng)計方法的要求非常簡單，一種適宜統(tǒng)計方法都可以描述其特征的變化規(guī)律。無論采用什么統(tǒng)計方法、選取哪次實驗的數(shù)據(jù)，控制好影響動物游泳狀態(tài)的相關注意事項，獲得穩(wěn)定可靠的實驗數(shù)據(jù)是獲得正確結論的基礎。統(tǒng)計處理方法不會影響實驗的結論。

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11閆盼盼，閆國利，詹向紅，等.Morris水迷宮檢實驗設計的統(tǒng)計學方法探析〔J〕.中國中醫(yī)藥學刊，2013;31(2):264-6.

R3

A

1005-9202(2017)24-6274-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.116

國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目基金項目(No.201411230046)；齊齊哈爾醫(yī)學院院內(nèi)基金項目(No.QY2014Z-12)

朱坤杰(1968-)，女，教授，醫(yī)學博士，主要從事神經(jīng)藥理學研究。

周嬌嬌(1992-)，女，在讀碩士，主要從事精神病與精神衛(wèi)生相關臨床研究。

〔2016-10-13修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)