腹主動(dòng)脈瘤組織中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表達(dá)及意義

李維顏 張 毅 谷順通 (天津市第五中心醫(yī)院血管外科,天津 300450)

腹主動(dòng)脈瘤組織中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表達(dá)及意義

李維顏 張 毅 谷順通 (天津市第五中心醫(yī)院血管外科,天津 300450)

目的探討低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2及MMP-9在腹主動(dòng)脈瘤(AAA)組織中的表達(dá)及意義。方法采用免疫組化法檢測(cè)68例AAA及20例正常腹主動(dòng)脈組織中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表達(dá)，并分析三者與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果HIF-1α表達(dá)于AAA中膜及外膜平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核中，MMP-2表達(dá)于AAA中膜及外膜平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，MMP-9表達(dá)于AAA中膜及外膜平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，三者在正常腹主動(dòng)脈組織中均不表達(dá)。AAA中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的陽性率顯著高于正常腹主動(dòng)脈(P<0.001)。AAA中動(dòng)脈瘤直徑≥5.0 cm的患者HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表達(dá)高于動(dòng)脈瘤直徑<5.0 cm者(P<0.001)；AAA中有發(fā)生心腦血管意外史患者HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表達(dá)高于未發(fā)生者(P<0.001)。AAA中HIF-1α、MMP-2及MMP-9與年齡、性別、有無吸煙史及高血壓無關(guān)。同時(shí)AAA中HIF-1α、MMP-2及MMP-9表達(dá)兩兩呈正相關(guān)。結(jié)論HIF-1α在AAA中高表達(dá)，并與MMP-2及MMP-9起協(xié)同作用，在AAA的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

腹主動(dòng)脈瘤；低氧誘導(dǎo)因子-1α；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

腹主動(dòng)脈瘤(AAA)是一種腹主動(dòng)脈壁的三層結(jié)構(gòu)持續(xù)性擴(kuò)張到正常腹主動(dòng)脈直徑的1.5倍以上的動(dòng)脈退行性疾病，一旦AAA破裂后，得不到及時(shí)救治其死亡率達(dá)到90%以上，并且其發(fā)病率居動(dòng)脈瘤首位〔1〕。目前研究認(rèn)為AAA是遺傳、環(huán)境、解剖學(xué)因素、免疫炎癥反應(yīng)、血流動(dòng)力學(xué)、病原微生物及平滑肌細(xì)胞凋亡等因素共同作用的結(jié)果〔2〕。吸煙、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血脂異常等是AAA發(fā)生的危險(xiǎn)因素，其中動(dòng)脈粥樣硬化使動(dòng)脈壁缺血、營養(yǎng)不足，進(jìn)而使中層膜平滑肌細(xì)胞凋亡〔3〕。低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α是缺血缺氧環(huán)境的中心調(diào)節(jié)因子，其信號(hào)通路與眾多血管疾病密切相關(guān)，包括動(dòng)脈粥樣硬化、主動(dòng)脈瘤、肺動(dòng)脈高壓與慢性靜脈疾病等〔4，5〕。另外，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)介導(dǎo)的動(dòng)脈壁彈力纖維及膠原纖維的降解及損傷是AAA病理最直觀的表現(xiàn)。研究顯示，在AAA形成過程中MMPs活性提高〔6〕。同時(shí)有研究表明HIF-1α對(duì)MMP-2及MMP-9的表達(dá)具有調(diào)控作用〔7〕，但三種在AAA中的聯(lián)合檢測(cè)及意義在國內(nèi)尚未見報(bào)道，本研究將對(duì)此展開討論。

1 材料與方法

1.1一般資料 取2011年1月至2016年10月天津市第五中心醫(yī)院手術(shù)，術(shù)前經(jīng)影像學(xué)及臨床診斷證實(shí)為AAA的患者68例標(biāo)本，其中男60例，女8例，≥60歲59例，<60歲9例，年齡68～85歲，中位年齡67歲。根據(jù)手術(shù)前1 w血管造影(CTA)測(cè)定的動(dòng)脈瘤體大小分：≥5.0 cm 43例，<5.0 cm 25例。同時(shí)選取20例無腹主動(dòng)脈病史及血管閉塞性病史的器官移植者或尸檢者的正常腹主動(dòng)脈作為對(duì)照。

1.2主要試劑及儀器 兔抗人HIF-1α、MMP-2及MMP-9多克隆抗體均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；二氯基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3免疫組化法檢測(cè)HIF-1α、MMP-2及MMP-9表達(dá) 石蠟標(biāo)本置于二甲苯、無水酒精、95%、85%、75%酒精中脫蠟。3%過氧化氫酶室溫孵育20 min，于枸櫞酸鹽修復(fù)液中置于微波爐中修復(fù)5 min。10%山羊血清室溫下封閉30 min。一抗溶液(兔抗人HIF-1α、MMP-2及MMP-9多克隆抗體，稀釋度為1∶200)，4℃過夜孵育，二抗溶液室溫下孵育1 h，DAB顯色后沖洗。蘇木素復(fù)染、1%鹽酸分化，氨水反藍(lán)。梯度酒精中脫水，二甲苯中透明，中性樹脂封片，并于顯微鏡下觀察。以磷酸鹽緩沖液(PBS)液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷 HIF-1α蛋白主要以在細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的顆粒作為陽性表達(dá)，MMP-2及MMP-9蛋白以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色及棕褐色的顆粒為陽性表達(dá)，由工作經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片。在高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，觀察細(xì)胞的染色情況。該切片的總得分是陽性細(xì)胞百分率乘以染色評(píng)分。按細(xì)胞的染色程度評(píng)分：未染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細(xì)胞所占百分率評(píng)分：未染色為0分，<25%為1分，25%～50%為2分，≥50%為3分。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行軟件t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1HIF-1α、MMP-2、MMP-9在AAA及正常腹主動(dòng)脈中的表達(dá) HIF-1α表達(dá)于AAA中膜及外膜平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核中，陽性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色顆粒，在正常腹主動(dòng)脈組織中不表達(dá)。MMP-2表達(dá)于AAA中膜及外膜平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，陽性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色顆粒，在正常腹主動(dòng)脈組織中不表達(dá)。MMP-9表達(dá)于AAA中膜及外膜平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，陽性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色顆粒，在正常腹主動(dòng)脈組織中不表達(dá)。AAA中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的陽性率〔61例(89.71%)，58例(85.29%)、62例(91.18%)〕顯著高于正常腹主動(dòng)脈(均為0；χ2=19.42、23.71、28.45;均P<0.001)。

2.2HIF-1α、MMP-2及MMP-9表達(dá)與AAA臨床病理參數(shù)的關(guān)系 AAA中動(dòng)脈瘤直徑≥5.0 cm者HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表達(dá)高于動(dòng)脈瘤直徑<5.0 cm者(P<0.001)；AAA中有發(fā)生心腦血管意外史患者的HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表達(dá)高于未發(fā)生者(P<0.001)。而AAA中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的表達(dá)與年齡、性別、有無吸煙史及高血壓無關(guān)。見表1。

表1 HIF-1α、MMP-2及MMP-9表達(dá)與AAA臨床病理參數(shù)的關(guān)系〔n(%)〕

2.3HIF-1α、MMP-2及MMP-9表達(dá)的相關(guān)性 AAA中HIF-1α與MMP-2，HIF-1α與MMP-9，MMP-2與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.428、0.452、0.517，均P<0.01)。

3 討 論

腹主動(dòng)脈壁中膜彈力蛋白及膠原降解，淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤，平滑肌細(xì)胞凋亡及血管新生是AAA組織學(xué)最為典型的變化〔2,8〕。而動(dòng)脈粥樣硬化是AAA發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊使腹主動(dòng)脈處于缺血狀態(tài)，導(dǎo)致動(dòng)脈壁局部營養(yǎng)缺乏及缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致血栓形成及平滑肌細(xì)胞凋亡，加劇AAA的程度〔3〕。HIF-1是缺氧微環(huán)境中所產(chǎn)生的一種調(diào)控因子，是在肝癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的一種缺氧元件，主要由HIF-1α及HIF-1β兩種亞基構(gòu)成，前者為催化亞基，決定著HIF的活性。在正常氧條件下，HIF-1α被羥基化，并通過泛素-蛋白酶體途徑降解。而在缺氧條件下呈幾何倍數(shù)的表達(dá)。研究顯示HIF-1α信號(hào)通路與眾多血管疾病密切相關(guān)，包括動(dòng)脈粥樣硬化、主動(dòng)脈瘤、肺動(dòng)脈高壓和慢性靜脈疾病等〔4,5〕。有研究發(fā)現(xiàn)在人AAA破裂邊緣發(fā)現(xiàn)了HIF-1α的存在〔6〕。也有研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α能表達(dá)于平滑肌及巨噬細(xì)胞中〔9〕。同時(shí)有研究還發(fā)現(xiàn)在血管緊張素Ⅱ 誘導(dǎo)的載脂蛋白E(ApoE)(-/-)小鼠AAA模型成形的28 d中，HIF-1α表達(dá)量持續(xù)上升〔15〕。本研究結(jié)果與研究報(bào)道一致〔9，10〕。而且本研究還說明AAA中HIF-1α的高表達(dá)提示了瘤體大小、心腦血管病史的有無，與楊世疆等〔11〕的研究通過敲除血管緊張素Ⅱ 誘導(dǎo)的ApoE(-/-)小鼠AAA模型中HIF-1α基因表達(dá)后，能顯著減少動(dòng)脈瘤大小，減弱巨噬細(xì)胞浸潤及新生血管形成的研究報(bào)道一致。本研究結(jié)果提示HIF-1α抑制劑作為AAA的輔助治療藥物無須考慮患者的性別、年齡、吸煙史及高血壓。

彈力蛋白及膠原是腹主動(dòng)脈細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，正常情況下，二者的合成與降解處于動(dòng)態(tài)平衡當(dāng)中，維持著腹主動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)與功能，而在病理?xiàng)l件下，由于炎癥細(xì)胞(巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞)分泌大量的MMPs，降解彈力蛋白，進(jìn)一步激活膠原酶，分解膠原蛋白，促使AAA動(dòng)脈的持續(xù)擴(kuò)張甚至破裂〔8〕。MMPs是一組依賴鈣、鋅離子的中性蛋白水解酶，能夠通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，參與傷口愈合、妊娠、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等。目前研究顯示MMPs活性及表達(dá)上升是AAA典型的病理變化，炎癥細(xì)胞分泌大量MMPs，降解膠原，膠原分解產(chǎn)物進(jìn)一步的促使白細(xì)胞趨化，浸潤組織，加重AAA〔6〕。其中明膠酶MMP-2能夠降解膠原及彈力蛋白，另外一種分子量最大的明膠酶MMP-9能夠降解Ⅳ型和Ⅴ型膠原和彈力蛋白。目前的研究證實(shí)AAA中MMP-2、MMP-9活性，蛋白及mRNA表達(dá)均顯著高于正常腹主動(dòng)脈組織〔6〕。本研究結(jié)果與通過抑制MMP-9表達(dá)能顯著降低動(dòng)脈瘤大小的研究報(bào)道一致〔6〕，也說明了MMP-2及MMP-9的表達(dá)受心腦血管病史的影響，臨床治療上需要考慮此影響。

有研究證實(shí)非小細(xì)胞肺癌中HIF-1α、MMP-2、MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)，三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肺癌的診斷及治療具有顯著意義〔11〕。且低氧能夠誘導(dǎo)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中HIF-1α、MMP-2及MMP-9的高表達(dá)〔9〕。在巨噬細(xì)胞接觸到鎳后能顯著促進(jìn)HIF-1α在細(xì)胞核內(nèi)聚集，進(jìn)而提高M(jìn)MP-2及MMP-9 mRNA表達(dá)。地塞米松能部分通過促進(jìn)HIF-1α的聚集，加重血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的AAA，同時(shí)還可以提高M(jìn)MP-2及MMP-9活性〔7〕。從而提示HIF-1α能夠通過調(diào)控MMP-2及MMP-9表達(dá)在AAA的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，作為HIF-1α的抑制劑可能成為AAA當(dāng)前的輔助治療藥物。

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R73

A

1005-9202(2017)24-6145-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.060

李維顏(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事血管外科疾病的腔內(nèi)手術(shù)治療研究。

〔2017-09-27修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)