腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和CD44在卵巢癌組織的表達(dá)及其臨床意義

童文先 何安兵 張 濤 鎮(zhèn)鴻燕 劉愛華 彭秀蘭 王 虎 田 倩 李曉光

(武漢市第五醫(yī)院腫瘤1科，湖北 武漢 430050)

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腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和CD44在卵巢癌組織的表達(dá)及其臨床意義

童文先 何安兵 張 濤1鎮(zhèn)鴻燕2劉愛華 彭秀蘭 王 虎 田 倩 李曉光

(武漢市第五醫(yī)院腫瘤1科，湖北 武漢 430050)

目的研究卵巢癌組織中CD133、CD44的表達(dá)及其與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系。方法免疫組化法檢測CD133、CD44在卵巢癌組織中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果CD133在卵巢癌組中陽性表達(dá)率分別為47.22%(17/36)，CD44陽性表達(dá)率分別為52.78%(19/36)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CD133和CD44的表達(dá)均與臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P<0.05)。Spearman相關(guān)性分析顯示CD133表達(dá)與CD44的表達(dá)有相關(guān)性(r=0.536，P=0.000)。結(jié)論CD133和CD44的高表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系。

卵巢癌；腫瘤干細(xì)胞；CD133；CD44

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)3大惡性腫瘤之一，死亡率卻高居婦科腫瘤首位，城市女性中卵巢癌發(fā)病率排在婦科腫瘤第一位〔1〕。美國癌癥協(xié)會最新預(yù)測美國2015年、2016年的卵巢癌的發(fā)病人數(shù)為21 290、22 280，死亡人數(shù)為14 180、14 240〔2，3〕；病死率高達(dá)66.6%、64.49%。由于卵巢癌病因不易發(fā)現(xiàn)，早期癥狀不夠典型，約70%患者初次診斷就已經(jīng)為晚期，且其中約70%患者兩年內(nèi)就會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移〔4〕。惡性腫瘤中存在少部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞群，具有自我更新能力，會導(dǎo)致腫瘤的無限生長；且具有多向分化潛能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性；常處于靜止休眠狀態(tài)，對放化療具有耐受能力。這些腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的根源，也是臨床上導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根本原因。因此，腫瘤干細(xì)胞的研究具有理論和實踐的雙重指導(dǎo)意義。五次跨膜糖蛋白CD133(又稱Prominin-1)，是多種腫瘤干細(xì)胞的重要表面標(biāo)記〔5〕。CD44是一種分布極廣泛黏附分子，是細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，主要功能為參與細(xì)胞、細(xì)胞以及細(xì)胞、基質(zhì)之間的特異性粘連過程〔6〕。目前，已有研究將CD133、CD44應(yīng)用在骨肉瘤〔7〕、胃癌〔8〕、肝癌〔9〕、結(jié)直腸癌〔10〕、舌鱗狀細(xì)胞癌〔11〕、胃腺癌〔12〕中，但是在卵巢癌中的聯(lián)合研究較少。本研究以卵巢癌為研究對象，通過免疫組織化學(xué)方法觀察干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和CD44的表達(dá)情況，并探討二者臨床表達(dá)的相關(guān)性，為以腫瘤干細(xì)胞為靶向的卵巢癌治療方案提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 收集2013年1月至2016年8月在武漢市第五醫(yī)院腫瘤科收治的具有完整病理資料的原發(fā)性卵巢癌手術(shù)切除標(biāo)本36例(患者在手術(shù)前均未進行放、化療及其他抗腫瘤治療)。入選病例隨訪至患者死亡或截止至2016年8月31日，隨訪時間為3～29個月?；颊吣挲g37～85歲，平均52.8歲；根據(jù)國際婦產(chǎn)科學(xué)聯(lián)盟(FIGO)關(guān)于卵巢癌的手術(shù)、病理分期的標(biāo)準(zhǔn)進行分類，早期(FIGO Ⅰ+Ⅱ期)卵巢癌11例，晚期(FIGO Ⅲ+Ⅳ期)卵巢癌25例；漿液性癌26例，黏液性癌5例，宮內(nèi)膜樣癌2例，透明細(xì)胞癌3例?；颊甙橛懈骨慌K器及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例，有腹水者21例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1試劑 一抗兔抗人CD133抗體、小鼠抗人CD44抗體、二抗為酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG合物，均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2.2免疫組化 石蠟包埋組織切片，用二甲苯、酒精進行脫蠟，蒸餾水漂洗5 min。3%過氧化氫常溫滅活10 min，水洗。通過EDTA稀釋10倍，微波爐大火煮約7～8 min，室溫冷卻5 min，再大火煮約7～8 min進行微波熱修復(fù)。冷卻0.5 h至室溫后，滴加5%BSA，37℃溫箱孵育0.5 h(不洗)做封閉處理。滴加一抗，37℃溫箱孵育2.0 h，PBS洗5 min×3次?？贵w稀釋濃度比為1∶100。滴加生物素化羊抗兔IgG(二抗)，37℃溫箱孵育0.5 h，PBS洗5 min×3次。滴加SABC，37℃溫箱孵育0.5 h，PBS洗5 min×3次。再進行DAB顯色，復(fù)染，返藍(lán)，封片，用顯微鏡觀察結(jié)果。

1.3結(jié)果判定 CD133、CD44均主要著色于胞質(zhì)和/或胞膜，按染色強度的差異，DAB陽性經(jīng)過染色成為棕色或黃色。在4個不同高倍視野下觀察200個癌細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞數(shù)量，如陽性細(xì)胞數(shù)>10%，則為陽性。若≤10%，則為陰性。該判定由3位病理科醫(yī)生獨立進行觀察判斷，若判斷不一致，則可對切片共同進行觀察。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS20.0軟件。計量資料分析采用t檢驗，計數(shù)資料分析應(yīng)用χ2檢驗；以Cox比例風(fēng)險回歸模型作多因素分析。

2 結(jié) 果

2.1隨訪結(jié)果 本組病例均采用電話或定期門診隨訪，36例患者均得到隨訪，中位隨訪時間18個月(2～30個月)，12例死亡，8例無瘤生存，16例帶瘤生存。

2.2卵巢癌組織中CD133和CD44的表達(dá) 36例卵巢癌組織中，共16例(44.44%)有轉(zhuǎn)移。CD133陽性表達(dá)率47.22%(17/36)(圖1)；CD44陽性表達(dá)率52.78%(19/36)(圖2)。

2.3CD133和CD44表達(dá)與卵巢癌臨床特征的關(guān)系 四種卵巢癌中常見的組織學(xué)分型間CD44陽性率無顯著差別(P>0.05)，四種組織學(xué)分型間CD133陽性率無顯著差別(P>0.05)，見表1。CD133陽性組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率與陰性組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CD44陽性組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率與陰性組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4原發(fā)性卵巢癌中腫瘤表面標(biāo)記物CD133與CD44表達(dá)的相互關(guān)系 本研究顯示原發(fā)性卵巢癌中腫瘤表面標(biāo)記物CD133與CD44的表達(dá)之間呈正相關(guān)性(r=0.536，P<0.05)，表2。

2.5Cox回歸分析 將卵巢癌患者年齡(分為≥50歲組與<50歲組)、FIGO分期(Ⅰ+Ⅱ期組與Ⅲ+Ⅳ期組)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)移組與無轉(zhuǎn)移組)、腹水(有腹水組與無腹水組)、CD133表達(dá)(陽性組與陰性組)、CD44表達(dá)(陽性組與陰性組)等相關(guān)因素引入Cox模型進行分析，CD133、CD44及FIGO分期是影響卵巢癌患者預(yù)后的獨立因素。見表3。

圖1 CD133陽性表達(dá)情況(DAB，×200)

圖2 CD44陽性表達(dá)情況(DBA，×200)

變量nCD133陽性P值CD44陽性P值年齡(歲)>005>005≤50167(4375)8(5000)>502010(5000)11(5500)組織類型(n)>005>005漿液型2611(4230)13(5000)黏液型53(6000)2(4000)內(nèi)膜樣21(5000)2(100．00)透明型32(6667)2(6667)臨床分期(n)<005<005Ⅰ～Ⅱ115(4545)7(6364)Ⅲ～Ⅳ2512(4800)12(4800)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(n)<005<005有168(5000)12(7500)無209(4500)7(3500)腹水(n)<005<005有2112(5714)13(6190)無155(3333)6(4000)

表2 CD133與CD44表達(dá)的關(guān)系(n)

表3 36例卵巢癌患者多因素分析

3 討 論

所謂腫瘤干細(xì)胞，指的是腫瘤中少數(shù)具有“干細(xì)胞性質(zhì)”的細(xì)胞。這些細(xì)胞常處于細(xì)胞周期的G0～G1期，放、化療對其很難起作用，它們可不斷自我更新，并持續(xù)分化出具有不同增殖活性的腫瘤細(xì)胞〔5〕。根據(jù)其這一特質(zhì)，常規(guī)治療很難根除腫瘤干細(xì)胞，這是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和影響治療效果的重要原因?，F(xiàn)在，已有較多研究將CD133和CD44用作腫瘤干細(xì)胞分離、鑒定等過程中的標(biāo)志物。CD133又可稱為Prominin-1，是Prominin家族的一位成員，具有五個跨膜結(jié)構(gòu)域和兩個糖基化膜外環(huán)的結(jié)構(gòu)〔13，14〕。近年來，多項研究證明CD133是多種惡性腫瘤干細(xì)胞普遍的表面標(biāo)記物，雖然我們對其功能并不完全了解，但是已有研究顯示，CD133的某些功能可能對腫瘤干細(xì)胞性質(zhì)的維持和分化發(fā)揮了相當(dāng)重要的作用。CD44是細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，是一種分布極廣泛黏附分子，其主要功能為參與細(xì)胞、細(xì)胞以及細(xì)胞、基質(zhì)之間的特異性粘連過程。目前，CD44蛋白作為多種已知腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物已經(jīng)有了相當(dāng)?shù)难芯砍晒?，越來越受到與生命科學(xué)科研工作者的重視。

此前，已有研究將CD133和CD44聯(lián)合用于研究骨肉瘤〔7〕、胃癌〔8〕、舌鱗狀細(xì)胞癌〔11〕、肺癌〔15〕組織的表達(dá)情況，證實CD133、CD44可以作為胃癌、舌癌和肺癌患者早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)CD133和CD44這兩種蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)在某種程度上可以體現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的表達(dá)和分布。根據(jù)這兩種標(biāo)記物的表達(dá)情況，能對患者的預(yù)后進行較為可靠的預(yù)測，指導(dǎo)臨床實踐。本研究還發(fā)現(xiàn)，CD44陽性的腫瘤干細(xì)胞在特殊的微環(huán)境作用下，能夠不斷的生長并向外遷移；并且分化越差的腫瘤，這種團簇狀的腫瘤干細(xì)胞群越多，腫瘤生長更快，預(yù)后更差。CD133蛋白的表達(dá)與卵巢癌患者的臨床分期及轉(zhuǎn)移關(guān)系有著緊密的聯(lián)系，若CD133蛋白表達(dá)陽性率較高，患者臨床分期相對較晚，就較容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

本研究由于病例數(shù)較少，缺乏隨機對照，且對CD133和CD44陽性細(xì)胞的特點及轉(zhuǎn)移機制的研究不足，對卵巢癌患者臨床預(yù)后的指導(dǎo)意義說明力度相對較弱，需要研究者進一步擴大樣本量進行研究，提高臨床的指導(dǎo)性。另外，需要找到在如血液等反映患者腫瘤干細(xì)胞狀態(tài)的相關(guān)標(biāo)記物，即時知曉腫瘤發(fā)展?fàn)顟B(tài)，為臨床治療和預(yù)后提供及時的信息，為卵巢癌患者診斷、治療和預(yù)后提供保障。這些需要在后續(xù)研究中進一步探討。

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R73

A

1005-9202(2017)24-6098-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.040

湖北省衛(wèi)生計生科研基金資助(WJ2015MB245)

1 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心

2 江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院

何安兵(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤放療學(xué)研究。

童文先(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤放療學(xué)研究。

〔2017-09-26修回〕

(編輯 袁左鳴)