FOXC2對(duì)肺腺癌細(xì)胞惡性增殖及侵襲遷移能力的影響

饒習(xí)敏 邢時(shí)云 歐陽瑤 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

FOXC2對(duì)肺腺癌細(xì)胞惡性增殖及侵襲遷移能力的影響

饒習(xí)敏 邢時(shí)云1歐陽瑤 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

目的探究叉頭框C2蛋白(FOXC2)對(duì)肺腺癌細(xì)胞惡性增殖及侵襲遷移能力的影響。方法利用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法在人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中構(gòu)建過表達(dá)FOXC2細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)及相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞系(對(duì)照組)，Western印跡檢測(cè)兩組細(xì)胞FOXC2及干性相關(guān)分子Oct4、Sox2及Nanog的表達(dá)水平，MTT法檢測(cè)兩組細(xì)胞0、24、48、72、96 h的惡性增殖能力，Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞侵襲遷移能力。結(jié)果與對(duì)照組細(xì)胞比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞FOXC2、Oct4、Sox2及Nanog表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞惡性增殖能力在48、72及96 h出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞侵襲及遷移能力均顯著上調(diào)(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論FOXC2可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞惡性增殖及侵襲遷移能力，其機(jī)制與介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性形成有關(guān)。

叉頭框C2蛋白；肺腺癌；惡性增殖；侵襲遷移；腫瘤干細(xì)胞

肺腺癌發(fā)病占全部肺癌的50%以上，是肺癌主要的病理類型〔1〕。肺腺癌多起源于小支氣管，為周圍型肺癌，故早期臨床癥狀較輕，但肺腺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，部分早期即發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，故多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期。因此，明確影響肺腺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵因子對(duì)臨床診斷及治療工作具有重要意義。叉頭框C2蛋白(FOXC2)在正常機(jī)體內(nèi)參與棕色脂肪代謝及血管生成等生物學(xué)過程〔2〕，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用，但對(duì)于肺腺癌惡性行為的影響尚不清楚。本研究擬探討FOXC2對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549增殖轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 儀器：ECO1.8垂直流超凈工作臺(tái)及3110生化培養(yǎng)箱(美國Thermo)，5417R高速離心機(jī)(德國Eppendorf)，DM1000光學(xué)顯微鏡(德國Leica)，TC20細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及Tek多孔酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad)，電泳槽、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及轉(zhuǎn)印夾等(上海天能)，Gel Doc XR凝膠成像儀(美國Bio-Rad)。

細(xì)胞：人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及人胚胎腎細(xì)胞293T(上海細(xì)胞生物研究所)。

試劑：DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、小牛血清及胎牛血清(美國Hyclone)，胰蛋白酶(美國Sigma)轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(美國Thermo)，慢病毒包裝載體pLP1-gag/pol、REV和VSV-G(美國Addgene)，F(xiàn)OXC2全長(zhǎng)載體及空白對(duì)照載體(上海吉瑪基因)，嘌呤霉素(美國Sigma)，MTT細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒(美國Promega)，Transwell小室及24孔板、Matrigel基質(zhì)膠(美國BectonDickinson)，RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑(cocktail)及考馬斯亮藍(lán)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物)，甲醇等無機(jī)試劑(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑)，abcam抗體：一抗：β-actin(ab8226)、FOXC2(ab24340)、Oct4(ab18976)、Sox2(ab92494)及Nanog(ab21624)；二抗：鼠二抗(ab6728)，兔二抗(ab150077)。PierceECL化學(xué)發(fā)光液(美國Thermo)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的構(gòu)建 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549采用DMEM/F12+10%胎牛血清培養(yǎng)，1∶3傳代；人胚胎腎細(xì)胞293T采用DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)，1∶3傳代。培養(yǎng)環(huán)境：37℃，5%CO2，100%相對(duì)濕度。

慢病毒包裝：培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%以上時(shí)，棄去上清并加入1 ml DMEM培養(yǎng)基備用。將pLP1-gag/pol、REV和VSV-G按0.75 μg、0.45 μg及0.30 μg的比例混合于2支含500 μl無血清DMEM的1.5 ml Eppendorf管中，并將1.5 μg FOXC2全長(zhǎng)載體及空白對(duì)照載體分別加入2支Eppendorf管中，室溫靜置5 min后與10 μl Lipofectamine 2000充分混合，室溫靜置30 min，將上述混合液緩慢均勻滴加入293T細(xì)胞中，生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集病毒懸液并過濾。慢病毒感染：將制備好的病毒懸液與DMEM/F12+10%胎牛血清1∶2混合培養(yǎng)A549細(xì)胞3 d，感染攜帶FOXC2全長(zhǎng)載體的A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，感染攜帶空白對(duì)照載體的A549細(xì)胞為對(duì)照組，1 μg/μl嘌呤霉素篩選細(xì)胞至生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

1.2.2Western印跡檢測(cè)兩組細(xì)胞FOXC2、Oct4、Sox2及Nanog的表達(dá) 收集融合度約為80%，培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿中的各組細(xì)胞：PBS洗細(xì)胞2次，600 μl胰蛋白酶消化，1 ml DMEM/F12+10%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化加入Eppendorf管，800 r/min室溫離心5 min，去上清后PBS洗細(xì)胞2次，加入RIPA蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑混合液500 μl，充分混勻后冰上裂解2 h，13 000 r/min，4℃離心細(xì)胞懸液15 min，取上清液置于新的Eppendorf管中，作為抽提的蛋白，經(jīng)BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量分析，配平體系后，配置10%聚丙烯酰胺凝膠，上樣量50 μg，80 V穩(wěn)壓電泳至條帶出積層膠，調(diào)整電壓至120 V穩(wěn)壓電泳1 h，260 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h，麗春紅染色，根據(jù)染色情況剪取β-actin、FOXC2、Oct4、Sox2及Nanog所在目的條帶，相應(yīng)抗體室溫孵育2 h(工作濃度為1∶1 000)，PBS洗膜3次，每次10 min；二抗孵育1 h(工作濃度為1∶2 000)，PBS洗膜3次，每次10 min，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)曝光顯影，ImageLab4.2軟件分析各條帶相比內(nèi)參基因β-actin的相對(duì)灰度值。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞惡性增殖能力 培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞于10 cm培養(yǎng)皿中，將待檢測(cè)細(xì)胞消化，重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2×103個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種至96孔板中，設(shè)置5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、24、48、72、96 h)及5個(gè)重復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，以此時(shí)為0 h時(shí)間點(diǎn)，棄去細(xì)胞上清液，將MTT試劑與DMEM/F12+10%胎牛血清培養(yǎng)基1∶5混合加入0 h時(shí)間點(diǎn)的孔中，設(shè)置空白孔，檢測(cè)各孔與空白孔490 nm吸光度，以各孔與空白孔OD值的差值作為增殖能力。同樣，在24、48、72、96 h檢測(cè)細(xì)胞的OD值，以各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞OD值與0 h細(xì)胞OD值的比值表示細(xì)胞惡性增殖能力。

1.2.4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞侵襲能力 將50 mg/L基質(zhì)膠與DMEM/F12培養(yǎng)基1∶8混合均勻，100 μl加至小室中央，置于37℃孵育6 h后取出備用。將各組細(xì)胞消化，PBS洗細(xì)胞3次后，DMEM/F12+1%小牛血清重懸細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5×104個(gè)細(xì)胞/孔加入鋪好基質(zhì)膠的上小室中，下小室加入500 μl DMEM/F12+10%胎牛血清，生化培養(yǎng)箱孵育24 h后，棉簽擦去上室面未穿透的細(xì)胞，10%甲醇固定細(xì)胞15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗細(xì)胞3次，200倍光鏡下計(jì)數(shù)，隨機(jī)統(tǒng)計(jì)中間和四周5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，求其均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.5Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中DMEM/F12+1%小牛血清重懸后的細(xì)胞取5×104個(gè)細(xì)胞/孔加入未鋪膠的上小室中，下小室同樣加入500 μl DMEM/F12+10%胎牛血清，生化培養(yǎng)箱孵育24 h后，固定、染色及計(jì)數(shù)方法同Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)的組間比較行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞FOXC2、Oct4、Sox2及Nanog的表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞FOXC2相對(duì)灰度值顯著高于對(duì)照組細(xì)胞，且細(xì)胞干性相關(guān)分子Oct4、Sox2及Nanog相對(duì)灰度值均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1，圖1。

2.2兩組細(xì)胞的惡性增殖能力比較 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在48、72、96 h時(shí)增殖能力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

2.3實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞的侵襲及遷移能力比較 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組侵襲基底膜的細(xì)胞數(shù)為(83.7±10.3)個(gè)，顯著多于對(duì)照組(54.8±9.5)個(gè)(P<0.05)；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷到下室的細(xì)胞數(shù)為(119.2±13.6)個(gè)，顯著多于對(duì)照組(66.3±11.2)個(gè)(P<0.05)，見圖2。

表1 兩組細(xì)胞FOXC2、Oct4、Sox2及Nanog的表達(dá)比較

圖1 兩組細(xì)胞FOXC2、Oct4、Sox2及Nanog的表達(dá)情況比較

組別24h48h72h96h對(duì)照組1926±03113892±04266921±080413574±2162實(shí)驗(yàn)組2050±03354473±04938772±103417520±2643t/P值0607/02801994/00403160/00072584/0016

圖2 兩組細(xì)胞的侵襲及遷移能力比較(×200)

3 討 論

FOXC2是人叉頭框蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子之一，在人體生長(zhǎng)發(fā)育及代謝中發(fā)揮重要作用，包括促進(jìn)胚胎組織的成熟及棕色脂肪組織的代謝，也可增強(qiáng)組織胰島素敏感性及血管的生成〔3～5〕。近年有研究顯示FOXC2參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌及前列腺癌等：①FOXC2與乳腺癌：FOXC2被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，且其蛋白表達(dá)與腫瘤高組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、早期復(fù)發(fā)、患者不良預(yù)后及原癌基因Twist表達(dá)均密切相關(guān)〔6〕，提示FOXC2對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)作用。另外體外研究顯示，F(xiàn)OXC2可通過激活乳腺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞(CSC)樣特性，進(jìn)而介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移及化療抵抗的形成〔7〕。②FOXC2與結(jié)直腸癌：FOXC2在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高TNM分期及不良預(yù)后密切相關(guān)〔8，9〕，F(xiàn)OXC2還可在體外促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，其機(jī)制與促進(jìn)原癌基因肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)-酪氨酸激酶受體EMT的信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)〔10〕。③FOXC2與胃癌：FOXC2在胃癌中同樣高表達(dá)，高FOXC2表達(dá)與胃癌細(xì)胞低分化程度、高TNM分期及不良預(yù)后正相關(guān)，是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔11〕。④FOXC2與前列腺癌：雄激素受體(AR)陰性的前列腺癌中FOXC2表達(dá)較高，此類細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，是前列腺癌藥物去勢(shì)抵抗形成的關(guān)鍵因素，體外敲降FOXC2表達(dá)后，前列腺癌細(xì)胞EMT進(jìn)程減弱且藥物去勢(shì)敏感性增強(qiáng)，表明FOXC2對(duì)前列腺癌發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)作用〔12〕。⑤FOXC2與卵巢癌：FOXC2在卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)，體外下調(diào)FOXC2表達(dá)后，細(xì)胞EMT進(jìn)程及侵襲轉(zhuǎn)移能力均顯著減弱〔13〕。另外，F(xiàn)OXC2可通過促進(jìn)EMT進(jìn)程介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞體內(nèi)外順鉑抵抗的發(fā)生〔14，15〕。⑥FOXC2與肺癌：FOXC2在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，且與患者肺腺癌發(fā)生、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān)，是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔16〕。

Oct4基因是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，主要表達(dá)于胚胎干細(xì)胞、生殖干細(xì)胞以及多種惡性腫瘤細(xì)胞中，是腫瘤干細(xì)胞樣表型的標(biāo)志物之一〔17〕；Sox2及Nanog是維持干細(xì)胞的多功能性、祖細(xì)胞自我更新能力的重要基因，同時(shí)也在多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展〔18，19〕。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2可顯著上調(diào)肺腺癌細(xì)胞干性相關(guān)分子Oct4、Sox2及Nanog的表達(dá)，提示FOXC2可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞干性的維持，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能；同時(shí)，F(xiàn)OXC2可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞惡性增殖及侵襲遷移能力，在體外揭示了FOXC2的促癌作用。

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R73

A

1005-9202(2017)24-6033-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.013

1 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科

歐陽瑤(1965-)，女，碩士，主任醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺病發(fā)病機(jī)制研究。

饒習(xí)敏(1984-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺病基礎(chǔ)與臨床研究。

〔2017-02-11修回〕

(編輯 徐 杰)