紅景天苷對慢性缺氧小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響

郭天笑 劉 嵩 張 琳 劉冬雪 楊子龍 劉松熠 徐煒燁 趙行宇

(吉林醫(yī)藥學(xué)院應(yīng)用心理學(xué)院，吉林 吉林 132013)

紅景天苷對慢性缺氧小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響

郭天笑 劉 嵩 張 琳 劉冬雪 楊子龍 劉松熠 徐煒燁 趙行宇

(吉林醫(yī)藥學(xué)院應(yīng)用心理學(xué)院，吉林 吉林 132013)

目的探討紅景天苷對慢性缺氧小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的影響及可能機制。方法昆明種小鼠90只，分為正常對照組、缺氧對照組及紅景天苷組，每組30只，置FLY-6型低壓艙內(nèi)，以1 m/s速度上升至7 000 m，停留30 min，1 m/s下降至地面，停留30 min，再上升，循環(huán)往復(fù)，持續(xù)8 w制成慢性缺氧模型。紅景天苷組小鼠每天灌胃給予200 mg/kg紅景天苷。實驗結(jié)束后，水迷宮檢測各組學(xué)習(xí)記憶能力，Hoechst檢測海馬齒狀回細胞凋亡情況，免疫組化檢測海馬齒狀回Bcl-2、Bax蛋白表達。結(jié)果與正常對照組比較，缺氧對照組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，海馬細胞凋亡明顯增加，Bcl-2表達明顯減少，Bax表達明顯增加(均P<0.05)；與缺氧對照組比較，紅景天苷組學(xué)習(xí)記憶能力明顯增加，海馬細胞凋亡明顯減少，Bcl-2表達明顯增加，Bax表達明顯減少(均P<0.01)。結(jié)論長期慢性缺氧可以導(dǎo)致小鼠海馬細胞凋亡，學(xué)習(xí)記憶功能下降；紅景天苷可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2及Bax蛋白表達，減少海馬細胞凋亡，從而改善慢性缺氧導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力下降。

慢性缺氧；學(xué)習(xí)記憶；凋亡

缺氧對人體的影響是多方面的，在急性嚴重的缺氧條件下，對腦認知功能的影響主要為快速的血氧下降所致的認知功能改變，而慢性缺氧主要表現(xiàn)為代償作用，但無論急性還是慢性缺氧，只要到一定的嚴重程度，都會導(dǎo)致不同程度與形式的認知功能障礙〔1,2〕。反復(fù)慢性缺氧暴露，會導(dǎo)致智力、注意、協(xié)調(diào)及解決問題的能力明顯下降〔3,4〕。一些慢性缺血、缺氧性疾病均可導(dǎo)致腦結(jié)構(gòu)改變，特別是膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元凋亡是腦功能改變的共同因素，正是這些改變導(dǎo)致腦認知功能改變〔5,6〕。紅景天苷是藏醫(yī)中重要的抗缺氧、抗疲勞藥物，在吉林等高寒山區(qū)亦有分布，紅景天苷中的許多提取成分都有抗缺氧功能。本文探討紅景天苷對慢性缺氧小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能的影響。

1 材料與方法

1.1動物與分組 昆明種小鼠90只，購于吉林大學(xué)動物實驗室，雌雄各半，平均體質(zhì)量(21.4±2.2)g，在本實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機分為正常對照組、缺氧對照組和紅景天苷組，每組30只。

1.2藥品與試劑 紅景天苷(哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，紅景天苷質(zhì)量分數(shù)為58.75%)；Hoechst、Bcl-2、Bax抗體購于碧云天生物有限公司，Morris水迷宮由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)，F(xiàn)LY-6低壓氧艙由成都風雷科技責任有限公司生產(chǎn)。

1.3實驗方法 正常對照組小鼠在低壓艙旁飼養(yǎng)，缺氧對照組和紅景天苷組置于低壓艙中，以1 m/s上升至7 000 m，停留30 min后，以1 m/s下降至地面，停留30 min再上升，如此循環(huán)，連續(xù)8 w；紅景天苷組每天每公斤體重灌胃給予紅景天苷200 mg，其他組給予等量體積生理鹽水。實驗結(jié)束時，進行水迷宮訓(xùn)練，訓(xùn)練時，每只小鼠在同一點入水2次，找到平臺后，休息30 s，進行下一次訓(xùn)練，120 s內(nèi)找不到平臺，引導(dǎo)上平臺，休息30 s，進行下一次訓(xùn)練，記錄小鼠逃避潛伏期。5 d后，進行定位航行實驗，撤去平臺，分別記錄從4個象限入水，游泳60 s，記錄經(jīng)過有效區(qū)平均停留時間。

1.4免疫組化檢測海馬組織Bcl-2、Bax蛋白的表達 每組取2只小鼠，乙醚麻醉，開胸，暴露心臟，剪開左心室插入灌注針頭至升主動脈，用止血鉗固定，快速灌注100～150 ml預(yù)冷的生理鹽水(4℃)，待右心耳鼓漲，呈球狀，剪開右心耳，血液沖洗干凈后，灌注4%多聚甲醛(4℃)500 ml。先快后慢，持續(xù)約2 h。 斷頭取小鼠腦組織，置入同濃度多聚甲醛溶液中浸泡固定10 h，常規(guī)石蠟包埋及組織切片，片厚5 μm。免疫組化觀察海馬組織Bcl-2、Bax的表達。

1.5Hoechst熒光檢測海馬細胞凋亡 用 Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞核呈藍色，凋亡細胞的胞核呈致密濃染或碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改變 與正常對照組比較，缺氧對照組逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，平均有效區(qū)停留時間減小(P<0.01)；紅景天苷組逃避潛伏期延長，但不顯著，平均有效區(qū)停留時間明顯減小(P<0.05)。與缺氧對照組比較，紅景天苷組逃避潛伏期有下降，但不顯著，平均有效區(qū)停留時間有延長(P<0.05)。見表1。

2.2各組海馬組織Bcl-2、Bax的表達 各組海馬齒狀回細胞Bcl-2蛋白表達見圖1，其中棕色顆粒為陽性染色顆粒，缺氧后顆粒量明顯減少，使用紅景天苷后，染色有所增加；Bax蛋白表達見圖2，缺氧后，染色明顯加深，紅景天苷干預(yù)后，染色變淺。各組平均光密度值(OD值)見表2。與正常對照組相比，缺氧對照組Bcl-2 OD值明顯降低(P<0.01)，紅景天苷組明顯高于缺氧對照組(P<0.05)，但明顯低于正常對照組(P<0.05)；缺氧對照組Bax明顯高于正常對照組(P<0.01)，紅景天苷組Bax明顯高于正常對照組(P<0.05)，但明顯低于缺氧對照組(P<0.05)。與正常對照組相比，缺氧對照組Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.01)，紅景天苷組明顯高于缺氧對照組(P<0.01)，但明顯低于正常對照組(P<0.01)。

2.3各組海馬組織細胞凋亡情況(Hoechst熒光染色法) 圖3可見，正常對照組染色淺，呈淡藍色，缺氧對照組細胞核顏色發(fā)白邊緣不規(guī)則，細胞核染色體濃集，并伴有細胞核固縮和細胞核碎片增加的現(xiàn)象，為細胞發(fā)生凋亡的典型特征。給予紅景天苷組顏色有所下降，上述凋亡現(xiàn)象減弱，漸呈淡藍色。

表1 各組小鼠逃避潛伏期與平均有效停留時間

與正常對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與缺氧對照組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

圖1 各組海馬齒狀回Bcl-2表達(DAB，×400)

圖2 各組海馬齒狀回Bax表達(DAB，×400)

組別Bcl?2BaxBcl?2/Bax正常對照組0542±00620386±00534)1496±0184缺氧對照組0361±00702)0460±00582)0795±01902)紅景天苷組0410±00571)3)0409±00571)3)1022±01692)4)

圖3 小鼠海馬齒狀回核熒光染色鏡下觀察(Hoechst染色法，×400)

3 討 論

慢性缺血缺氧性疾病在臨床多種疾病中都可出現(xiàn)，由于長期較強程度的缺氧，神經(jīng)細胞會由于能量代謝等變化誘發(fā)神經(jīng)細胞變性、凋亡甚至出現(xiàn)纖維纏結(jié)。細胞凋亡是組織結(jié)構(gòu)改建的步驟之一，為機體生長不可或缺的條件，同時細胞凋亡也為細胞受損后提供了一種比壞死更有效減弱損傷對機體作用的方式，是由損傷因素啟動的一系列細胞內(nèi)生化反應(yīng)過程，也是一個主動耗能的過程，為細胞內(nèi)凋亡程序所控制。Bcl-2基因與凋亡的關(guān)系密切，對線粒體膜完整性具有保護作用，可能是此基因抗凋亡作用的主要機制。Bcl-2的表達水平可反映海馬細胞的凋亡情況，研究發(fā)現(xiàn)針對缺血缺氧損傷的藥物可使機體細胞Bcl-2表達上升，細胞凋亡減少〔7,8〕。 本研究顯示缺氧后Bax表達增加，Bcl-2表達下降，說明海馬細胞的凋亡與該變化有關(guān)，凋亡相關(guān)蛋白在慢性缺氧小鼠的海馬細胞凋亡中起到了重要的作用。缺氧后，細胞能量產(chǎn)生障礙，并引起中性蛋白酶活性的病理性增加，可使細胞膜結(jié)構(gòu)分解，細胞骨架破壞導(dǎo)致細胞死亡〔9～13〕。研究表明紅景天苷具有抗缺氧的作用〔14,15〕。本實驗提示紅景天苷抑制缺氧后海馬細胞凋亡的可能機制是使Bcl-2的表達增加，Bax的表達下降，從而抑制細胞的凋亡，保護海馬細胞。

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R395;R285

A

1005-9202(2017)24-6029-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.011

吉林省科技廳科技發(fā)展項目(No.20130101157JC)；吉林省教育廳“十一五”科學(xué)技術(shù)研究項目(No.2010-255)；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目(No.2014-363)

趙行宇(1970-)，男，副教授，主要從事生理心理學(xué)研究。

郭天笑(1987-)，男，碩士，助教，主要從事思想政治教育、心理健康教育研究。

〔2016-03-24修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)