基因沉默Smad3對四氯化碳致急性肝損傷的保護(hù)作用

王東輝 方 琳 朱 妍 陳 維 (長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，吉林 長春 3003)

基因沉默Smad3對四氯化碳致急性肝損傷的保護(hù)作用

王東輝 方 琳 朱 妍 陳 維1(長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，吉林 長春 130031)

目的探討基因沉默小鼠Smad3對四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)急性肝損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法將36只小鼠隨機(jī)平均分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，向Ⅱ、Ⅳ組小鼠尾靜脈注射Smad3 shRNA以抑制Smad3基因表達(dá)，Ⅰ、Ⅲ組注射空載體作為對照；向Ⅲ、Ⅳ組小鼠腹腔內(nèi)注射CCl4橄欖油溶液誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生肝臟損傷，構(gòu)建小鼠肝損傷模型，Ⅰ、Ⅱ組小鼠僅注射橄欖油作為對照；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測小鼠肝臟組織Smad3 mRNA的表達(dá)水平；采用賴氏法檢測小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平；取小鼠肝臟組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察其病理改變。結(jié)果Ⅳ組小鼠肝組織Smad3 mRNA表達(dá)水平明顯低于Ⅲ組(P<0.01)；血清ALT、AST水平明顯低于Ⅲ組(P<0.01)；顯微鏡下觀察可見Ⅳ組小鼠肝組織細(xì)胞變性、壞死數(shù)明顯少于Ⅲ組，肝組織損傷程度明顯較輕。結(jié)論基因沉默Smad3可減輕CCl4對小鼠的肝臟損傷作用，其機(jī)制可能為Smad3 基因沉默使小鼠體內(nèi)自身產(chǎn)生Smad3蛋白減少，削弱了Smad3蛋白對激活素信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)作用，減輕激活素(ACT)A介導(dǎo)的肝損傷程度。

Smad3；基因沉默；急性肝損傷

老年患者的肝病15%～20%是由藥物引起〔1〕。激活素(ACT)屬于轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β家族成員，能促進(jìn)細(xì)胞生長分化〔2〕。其中ACTA生理作用最為廣泛，可通過介導(dǎo)細(xì)胞增殖分化、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等方面在疾病的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其發(fā)病機(jī)制仍不明確〔3，4〕。ACT可與ACT Ⅰ型受體(ActRⅠ)、ActRⅡ形成復(fù)合物并磷酸化，磷酸化后的ActRⅠ將信號(hào)傳給下游的受體型Smad2、3，磷酸化的Smad2、3再與通用型Smad4形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)功能〔5〕。本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默小鼠Smad3基因，觀察其對四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器 雄性C57BL/6近交系小鼠(清潔級(jí)，合格證號(hào)SCXK(京)2009-0004)36只，體重(20±2)g(北京華阜康動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司)。CCl4(北京化工廠)；食用橄欖油購自北京可麗佩翠橄欖油開發(fā)中心；Trizol 試劑(Invitrogen公司)；SYBR qPCR檢測試劑盒(TaKaRa公司)；核酸及蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品(Bio-Rad公司)。CCl4溶液配制：向9.5 ml橄欖油中加入CCl4試劑0.5 ml，配制成5% CCl4溶液。7300型定時(shí)定量PCR儀(美國ABI公司)；Epoch超微量微孔板分光光度計(jì)(Biotech，美國)；CX41型生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2動(dòng)物分組和模型建立 將36只實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)平均分為Ⅰ組(橄欖油+空載體組)、Ⅱ組(橄欖油+ Smad3基因沉默組)、Ⅲ組(CCl4+空載體組)、Ⅳ組(CCl4+ Smad3基因沉默組)。Ⅰ組：向小鼠尾靜脈注射空載質(zhì)粒pGCsi-U6/Neo(3 μg/只)，12 h后腹腔注射橄欖油試劑(10 ml/kg體重)。Ⅱ組：小鼠尾靜脈注射Smad3基因沉默質(zhì)粒(3 μg/只)，12 h后腹腔注射橄欖油(10 ml/kg體重)。Ⅲ組：向小鼠尾靜脈注射空載質(zhì)粒pGCsi-U6/Neo(3 μg/只)，12 h后向腹腔注射5% CCl4橄欖油溶液(10 ml/kg體重)。Ⅳ組：向小鼠尾靜脈注射Smad3基因沉默質(zhì)粒(3 μg/只)，12 h后向腹腔注射5% CCl4橄欖油溶液(10 ml/kg體重)。各組小鼠處理后第3天用生理鹽水進(jìn)行心臟灌流，處死并收集血清、肝臟組織。

1.3血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)測定 于小鼠眼部取外周血，收集于抗凝管中，室溫靜置30 min，3 500 r/min離心10 min得上層血清。制備好血清樣品后按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別檢測血清中ALT及AST水平，于490 nm波長處測定吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線方程求得樣品值。

1.4小鼠肝組織Smad3 mRNA水平定量檢測 采用Trizol法提取小鼠肝臟組織總RNA，檢測RNA含量及純度，RNA質(zhì)檢合格后取1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(總體系為20 μl)，將產(chǎn)物稀釋10倍，取2 μl進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物的特異性通過溶解曲線檢測，以 GAPDH值為內(nèi)參照計(jì)算 Smad3 mRNA 的相對量。采用 2-ΔΔCt值表示目的基因的相對表達(dá)水平，其中，ΔCt =(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)，ΔΔCt =(ΔCt 實(shí)驗(yàn)組-ΔCt 對照組)。

1.5小鼠肝組織病理學(xué)觀察 取小鼠肝右葉新鮮組織標(biāo)本，使用濃度為40 g/L的多聚甲醛固定，24 h后行常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度3～4 μm)，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1基因沉默Smad3動(dòng)物模型的建立 Ⅳ組小鼠Smad3 mRNA表達(dá)水平(0.734±0.075)顯著低于其余各組(Ⅰ組：1.328±0.027，Ⅱ組：1.071±0.309，Ⅲ組：2.018±0.017)。

2.2基因沉默Smad3對小鼠血清ALT、AST水平的影響 Ⅳ組小鼠血清ALT及AST水平〔(1 056.36±105.37)、(669.87±39.74)U/L〕均明顯低于Ⅲ組〔(2 767.14±217.28)、(1 373.07±179.34)U/L，P<0.01〕。Ⅰ組分別為(19.65±0.36)、(28.84±0.78)U/L，Ⅱ組為(19.02±0.47)、(21.68±0.43)U/L。

2.3小鼠肝組織的病理改變 Ⅰ、Ⅱ組小鼠肝臟組織細(xì)胞呈索狀排列且呈多邊形，有1～2個(gè)圓形細(xì)胞核，核仁明顯，核膜清楚，核內(nèi)染色質(zhì)稀疏，呈正常肝細(xì)胞狀態(tài)。而Ⅲ、Ⅳ組肝細(xì)胞部分表現(xiàn)為核固縮、溶解或消失，出現(xiàn)變性、壞死，其中與Ⅲ組小鼠相比，Ⅳ組小鼠肝損傷明顯減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟病理改變(HE，×200)

3 討 論

各種因素導(dǎo)致的肝損傷在肝病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。以往的研究表明TGF-β參與肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展，TGF-β是一簇具有多種功能的蛋白多肽，目前至少發(fā)現(xiàn)有 5 種異構(gòu)體，分別為 TGF-β1～5，均對細(xì)胞的生長、分化與免疫反應(yīng)有廣泛的影響〔6〕。TGF-β1超家族成員ACT是一種與肝損傷有關(guān)的致炎因子。ACT有5種亞基，可分別形成ACT A、ACT B、ACT C等 9 種激素〔2〕，ACT A在刀豆蛋白(Con)A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷過程中發(fā)揮重要的致病作用〔7〕。

ACT信號(hào)傳導(dǎo)分為細(xì)胞外傳導(dǎo)、受體傳導(dǎo)和受體后傳導(dǎo)，Smads是ACT受體下游的信號(hào)分子，通過Smads蛋白調(diào)控屬于受體后調(diào)節(jié)〔5〕，Smad蛋白有8種型，受體調(diào)節(jié)型 Smad(R-Smads)包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和 Smad8，通用型Smad(Co-Smads)只有Smad4，抑制型Smad(I-Smads)有Smad6和Smad7〔8〕。ACT依次與ActRⅡ、ActRⅠ結(jié)合，并使其磷酸化，進(jìn)而激活下游的Smad2/3，從而進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)〔9〕。有研究者采用 RNA 干擾技術(shù)，將針對 Smad3的siRNA 轉(zhuǎn)染入肝星狀細(xì)胞(HSCs)，結(jié)果抑制了 HSCs 的增殖，而且還可上調(diào)P53、下調(diào)Bcl-2表達(dá)，從而促進(jìn) HSCs 凋亡，最終達(dá)到抑制肝纖維化發(fā)展的目的〔10〕。CCl4誘導(dǎo)肝損傷模型是目前急性肝損傷的經(jīng)典模型，損傷作用主要是由于炎癥因子的過量釋放和炎性細(xì)胞的大量聚集而產(chǎn)生。另外，作為調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要因子，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ也在急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用〔11〕。

本研究結(jié)果提示ACT信號(hào)傳導(dǎo)途徑ACT A-ActRⅡA-Smad途徑的阻斷削弱了CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，基因沉默Smad3對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷有一定的保護(hù)作用。

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R575

A

1005-9202(2017)24-6023-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.008

吉林省科技發(fā)展項(xiàng)目(20060928-01)

1 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

陳 維(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腦血管疾病臨床研究。

王東輝(1968-)，女，博士，教授，主要從事基因治療及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)研究。

〔2017-03-20修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)