信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3基因在老年甲狀腺癌組織中的表達(dá)及基因沉默對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的影響

尤鳴達(dá) 李巖冰 張春英 (河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院頭頸外科，河北 唐山 063000)

信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3基因在老年甲狀腺癌組織中的表達(dá)及基因沉默對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的影響

尤鳴達(dá) 李巖冰 張春英 (河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院頭頸外科，河北 唐山 063000)

目的觀察信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3基因在老年甲狀腺癌組織中的表達(dá)及沉默STAT3基因?qū)谞钕侔┘?xì)胞的影響。方法將FTC-133細(xì)胞分為siRNA STAT3組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，RT-PCR測(cè)定FTC-133細(xì)胞STAT3、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9 mRNA的表達(dá)，Western印跡測(cè)定甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞STAT3蛋白的表達(dá)，MTT法測(cè)定甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞的生長(zhǎng)，Transwell法檢測(cè)FTC-133細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果老年甲狀腺癌組織中STAT3陽(yáng)性率高于癌旁組織(P<0.05)。siRNA STAT3組FTC-133細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)量低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)。siRNA STAT3組FTC-133細(xì)胞中STAT3、MMP2、MMP9 mRNA的表達(dá)量低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)。siRNA STAT3組第1、2、3天的抑制率均明顯高于陰性對(duì)照組(P<0.05)。siRNA STAT3組FTC-133細(xì)胞中穿膜細(xì)胞數(shù)低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論老年甲狀腺癌組織中STAT3呈高表達(dá)，沉默STAT3基因?qū)谞钕侔┘?xì)胞株的增殖和侵襲能力有抑制作用。

信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3；甲狀腺癌；基因沉默

高分化的甲狀腺癌多數(shù)能夠通過手術(shù)治療、碘131內(nèi)放射治療等取得比較好的效果，但部分患者出現(xiàn)失分化，其轉(zhuǎn)移灶的攝碘能力喪失或者降低。失分化的甲狀腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移速度比較快，侵襲力比較強(qiáng)，是甲狀腺癌預(yù)后的重要影響因素。因低分化或者失分化的甲狀腺癌不能進(jìn)行常規(guī)的聯(lián)合治療，新興的生物治療對(duì)低分化或者失分化的甲狀腺癌可能具有重要意義〔1，2〕。腫瘤的發(fā)生和多種因素有關(guān)，抑癌基因、癌基因、凋亡相關(guān)基因、細(xì)胞周期調(diào)控因子、血管生長(zhǎng)因子等都和腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，甲狀腺癌基因領(lǐng)域的研究有酪氨酸激酶受體基因的重排、BRAF基因突變、Ras基因點(diǎn)突變等〔3，4〕。信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)與多種腫瘤關(guān)系密切〔5，6〕，與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展也有一定關(guān)系，在甲狀腺癌組織中呈高表達(dá)〔7～9〕。本文對(duì)老年甲狀腺癌組織中STAT3的表達(dá)情況進(jìn)行研究，并觀察基因沉默STAT3對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇唐山工人醫(yī)院2014年6月至2016年6月老年甲狀腺乳頭狀癌組織40例及癌旁組織40例，女29例，男11例；年齡(67.23±6.32)歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例；TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期5例，Ⅲ期14例；40例患者均經(jīng)病理證實(shí)為甲狀腺癌，均為甲狀腺首次手術(shù)患者，手術(shù)前未進(jìn)行放化療及免疫治療。

1.2主要試劑 甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞株(上海生命科學(xué)研究院)，兔抗人STAT3多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，RT-PCR試劑盒、MTT試劑盒、Transwell小室(美國(guó)Corning公司)等。

1.3方法

1.3.1老年甲狀腺癌及癌旁組織中STAT3表達(dá) 取甲狀腺癌及癌旁組織石蠟標(biāo)本切成厚5 μm切片，采用免疫組化法測(cè)定STAT3的表達(dá)情況，一抗為兔抗人STAT3多克隆抗體，陰性對(duì)照為磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為STAT3陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.2FTC-133細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將生長(zhǎng)良好的FTC-133細(xì)胞分為siRNA STAT3組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，接種到24孔板中培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)85%以上融合時(shí)，加入siRNA/lipofectamin復(fù)合物，siRNA STAT3組轉(zhuǎn)染STAT3-siRNA/lipofectamin復(fù)合物，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA/lipofectamin復(fù)合物，空白對(duì)照組未進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞。

1.3.3FTC-133細(xì)胞STAT3、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法測(cè)定目的基因和內(nèi)參基因β-actin的積分光密度值，目的基因的相對(duì)表達(dá)量=目的基因積分光密度值/β-actin的積分光密度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)7次，取平均值。

1.3.4FTC-133細(xì)胞STAT3蛋白檢測(cè) 采用Western印跡檢測(cè)FTC-133細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)量，STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量=STAT3光密度值/β-actin的光密度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次，取平均值。

1.3.5FTC-133細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)FTC-133細(xì)胞的增殖，酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處光密度值，計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=(空白對(duì)照組的光密度值-實(shí)驗(yàn)組的光密度值)/空白對(duì)照組的光密度值。

1.3.6FTC-133細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力，取7個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，每組7個(gè)復(fù)孔，取平均值作為穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用方差分析，組內(nèi)均數(shù)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1STAT3在老年甲狀腺癌及癌旁組織中的表達(dá) 在老年甲狀腺癌細(xì)胞中，STAT3陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，甲狀腺癌組織中STAT3陽(yáng)性率為72.5%，明顯高于癌旁組織中STAT3陽(yáng)性率7.5%(χ2=35.208，P<0.05)。

2.2甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)情況 siRNA STAT3組FTC-133細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)量(0.214±0.034)低于陰性對(duì)照組(0.397±0.042)和空白對(duì)照組(0.409±0.043)(P<0.05)，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞中STAT3 mRNA的表達(dá)情況 siRNA STAT3組甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞中STAT3 mRNA的表達(dá)量(0.112±0.022)低于陰性對(duì)照組(0.188±0.079)和空白對(duì)照組(0.205±0.043)(P<0.05)，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4siRNA STAT3對(duì)甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 siRNA STAT3組第1、2、3天的抑制率分別為(15.55±1.12)%、(59.92±6.88)%、(54.46±7.89)%，陰性對(duì)照組分別為(3.43±0.77)%、(12.08±3.35)%、(8.15±1.56)%；siRNA STAT3組第1、2、3天的抑制率均明顯高于陰性對(duì)照組(P<0.05)。

2.5siRNA STAT3對(duì)甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞侵襲力的影響 siRNA STAT3組FTC-133細(xì)胞中穿膜細(xì)胞數(shù)(114.8±16.5)低于陰性對(duì)照組(156.9±6.7)和空白對(duì)照組(166.7±11.4)(P<0.05)，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6siRNA STAT3對(duì)甲狀腺癌FTC-133細(xì)胞MMP2、MMP9 mRNA的影響 siRNA STAT3組FTC-133細(xì)胞MMP2、MMP9 mRNA水平低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組MMP2、MMP9 mRNA水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 siRNA STAT3對(duì)FTC-133細(xì)胞MMP2、MMP9 mRNA的影響

與siRNA STAT3組比較：1)P<0.05

3 討 論

STAT3是STATs家族成員之一，在維持胚胎干細(xì)胞多能性中發(fā)揮重要作用。STAT3基因的過度激活或者過度表達(dá)能夠抵抗細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞無(wú)限生長(zhǎng)，促使細(xì)胞發(fā)生癌變，過度激活的STAT3能夠進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因DNA特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)MMP2、MMP9、cMyc等基因的表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)存活的調(diào)控。鐘寶元等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中STAT3陽(yáng)性表達(dá)率增加；STAT3與結(jié)直腸癌的浸潤(rùn)深度、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)；STAT3可能通過抑制E-cadherin促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)STAT3和甲狀腺癌的關(guān)系也比較密切〔11，12〕，黃雋等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)STAT3在甲狀腺癌組織中的表達(dá)增加，與甲狀腺癌組織分化、AJCC分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切；汪永旭等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)STAT3在甲狀腺癌組織中表達(dá)增加，和甲狀腺癌患者的年齡、包膜侵犯、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。本研究結(jié)果也表明，STAT3和老年甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

RNA干擾技術(shù)是一種高效、快捷、經(jīng)濟(jì)的特異基因表達(dá)抑制技術(shù)，在基因表達(dá)調(diào)控的研究中被廣泛應(yīng)用，在惡性腫瘤的研究中也被廣泛應(yīng)用。本文采用RNA干擾技術(shù)沉默STAT3基因，發(fā)現(xiàn)RNA干擾技術(shù)可以有效抑制甲狀腺癌細(xì)胞中STAT3基因的過度表達(dá)，對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力有一定抑制作用，能夠降低甲狀腺癌細(xì)胞中MMP2 和MMP9的表達(dá)。STAT3有希望成為甲狀腺癌基因治療的靶點(diǎn)。MMP2 和MMP9能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解能力，改變細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞和細(xì)胞之間的黏附能力，促進(jìn)腫瘤內(nèi)新生血管的形成和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。沉默STAT3基因?qū)谞钕侔┘?xì)胞侵襲力的抑制作用可能與其抑制MMP2 和MMP9的表達(dá)有關(guān)。

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R73

A

1005-9202(2017)24-6017-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.005

尤鳴達(dá)(1973-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事頭頸外科腫瘤方面研究。

〔2017-01-15修回〕

(編輯 徐 杰)