白細(xì)胞介素-8對(duì)人肺癌A549細(xì)胞放療敏感性的影響

阮肇?fù)P 應(yīng)可凈 (浙江大學(xué)，浙江 杭州 30058)

白細(xì)胞介素-8對(duì)人肺癌A549細(xì)胞放療敏感性的影響

阮肇?fù)P 應(yīng)可凈1(浙江大學(xué)，浙江 杭州 310058)

目的探討白細(xì)胞介素(IL)-8對(duì)人肺癌A549細(xì)胞放療敏感性的影響。方法將A549細(xì)胞又分為對(duì)照組、照射組及IL-8組，IL-8組細(xì)胞分為三個(gè)亞組(分別用0.1、0.2、0.5 μg/ml IL-8處理)。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖抑制率(IR)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，Western印跡檢測(cè)Caspase-3、bcl-2及bax表達(dá)水平。結(jié)果IL-8組細(xì)胞的G0/G1及S期細(xì)胞比例及bcl-2表達(dá)顯著高于照射組(P<0.05)，Caspase-3及bax表達(dá)水平顯著低于照射組(P<0.05)；0.5 μg/ml IL-8處理細(xì)胞的IR、細(xì)胞周期、Caspase-3、bax及bcl-2表達(dá)水平與0.1、0.2 μg/ml IL-8組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論IL-8能夠降低A549細(xì)胞的放療敏感性。

白細(xì)胞介素(IL)-8；A549細(xì)胞；放射治療；敏感性

2004～2010年中國(guó)肺癌死亡分布及趨勢(shì)分析顯示，肺癌仍然是我國(guó)死亡率最高的惡性腫瘤〔1〕。老年人是肺癌發(fā)病及死亡的高危群體，患者因常合并多種基礎(chǔ)疾病，肺癌表現(xiàn)不典型，診斷時(shí)已經(jīng)處于中晚期，部分患者一般狀態(tài)較差，既使診斷較及時(shí)也因不能耐受手術(shù)而錯(cuò)失治療機(jī)會(huì)〔2,3〕。放射治療是肺癌臨床治療的重要手段之一，但部分患者對(duì)放療的敏感性較差，尤其以非小細(xì)胞肺癌患者多見(jiàn)〔4〕。隨著腫瘤免疫的發(fā)展，多種細(xì)胞因子在腫瘤治療中的作用引起廣泛的注意。既往研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素(IL)-8在多種腫瘤細(xì)胞(肺癌、肝癌及乳腺癌等)的增殖及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用〔5〕。但目前關(guān)于IL-8對(duì)肺癌患者放療敏感性的研究較少，本研究旨在探討IL-8對(duì)人肺癌A549細(xì)胞放療敏感性的影響。

1 材料及方法

1.1細(xì)胞 人肺癌A549細(xì)胞株由浙江大學(xué)提供。

1.2主要試劑及儀器 試劑：IL-8 1640培養(yǎng)液及胎牛血清(Gibco公司，美國(guó))；噻唑藍(lán)(MTT)及二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司，美國(guó))；碘化丙啶(PI，上海翊圣生物科技有限公司)；Gel DoxTM XR+凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司，美國(guó))；Caspase-3，bcl-2、bax及β-actin抗體、BCA定量及Western印跡試劑(Invitrogen公司，美國(guó))。儀器：FCC-7000型同中心回轉(zhuǎn)式60Co治療機(jī)(山東新華醫(yī)療器械股份公司)；超凈無(wú)菌工作臺(tái)(Spetec公司，德國(guó))；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國(guó))，低速離心機(jī)(Beckman Coulter公司，美國(guó))；倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)；酶標(biāo)儀(Biotek公司，美國(guó))，thermo fisher流式細(xì)胞儀(Thermo公司，美國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 按3×105個(gè)細(xì)胞/ml的密度將細(xì)胞懸液接種于96孔板培養(yǎng)，1 ml/孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞面積生長(zhǎng)至70%～80%后傳代。

1.3.2細(xì)胞分組及處理 將所有細(xì)胞分為三組：對(duì)照組、IL-8組及照射組。對(duì)照組不進(jìn)行進(jìn)行特殊處理，IL-8組細(xì)胞分為三個(gè)亞組，分別在培養(yǎng)基中加入不同濃度IL-8(0.1、0.2、0.5 μg/ml)，每一組細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，IL-8組及照射組均接受X射線照射：在96孔板上加蓋1.5 cm的有機(jī)玻璃，置于室溫下，采用6 MV的射線處理，源皮距為100 cm，照射劑量為2 Gy(200 cGy/min)。

1.3.3細(xì)胞增殖抑制率(IR)檢測(cè) 分別于24、48、72 h采用MTT檢測(cè)A549細(xì)胞的情況：各組細(xì)胞處理完后去除培養(yǎng)基，加入RPMI1640培養(yǎng)液100 μl/孔及含0.5%MTT的培養(yǎng)液(5 μl/孔)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄培養(yǎng)液，加入100 μl DMSO原液，振蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，IR=(1-OD處理/OD對(duì)照)×100.00%。觀察不同濃度的IL-8對(duì)IR的影響。

1.3.4檢測(cè)細(xì)胞周期變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制備細(xì)胞密度為3×105個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，將1 ml的細(xì)胞懸液置于6孔板中，細(xì)胞的分組及處理方式同1.3.2。將各組細(xì)胞于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)72 h后進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)：去除上清液，每孔加入0.3 ml的0.25%胰蛋白酶消化120 s，收獲細(xì)胞。用4℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，置于70%的冷乙醇溶液中固定過(guò)夜，PI染色30 min后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，計(jì)算G0/G1、G2+M期和S期細(xì)胞所占的比例。

1.3.5Western印跡檢測(cè)Caspase-3，bcl-2及bax表達(dá)水平變化 24 h后，Western印跡檢測(cè)對(duì)照組、IL-8組及照射組Caspase-3、bcl-2及bax表達(dá)水平。按照說(shuō)明書(shū)用蛋白裂解液(含磷酸酶抑制劑)裂解30～60 min，4℃，12 000 r/min離心5 min獲取總蛋白，BCA法測(cè)濃度后各取30 μg蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜60～90 min；5%脫脂奶粉/TBST室溫封閉1～2 h，Caspase-3、bcl-2及bax(稀釋倍數(shù)1∶1 000)抗體4℃孵育過(guò)夜；1∶5 000 β-actin室溫孵育1.5 h，TBST洗膜10 min×3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×2次，TBS洗膜5 min，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒色，顯影，Gel Doxtm XR+凝膠成像系統(tǒng)成像，圖像分析采用Quantity One軟件，取各條帶透光體積與內(nèi)參條帶的比值作為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞不同時(shí)刻的IR比較 對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)IR均為0。與照射組相比，不同濃度IL-8處理細(xì)胞的抑制率顯著降低(P<0.05)。0.5 μg/ml IL-8組細(xì)胞的抑制率低于0.2 μg/ml、0.1 μg/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞的IR比較

與照射組比較：1)P<0.05；與0.5 μg/ml組比較：2)P<0.05

2.2各組細(xì)胞的細(xì)胞周期比較 與對(duì)照組相比，照射組細(xì)胞的G0/G1及S期細(xì)胞比例顯著降低，G2+M期細(xì)胞比例顯著增多(P<0.05)。不同濃度的IL-8處理后，細(xì)胞的G0/G1及S期細(xì)胞比例顯著高于照射組，G2+M期細(xì)胞比例低于照射組(P<0.05)；0.5 μg/ml IL-8組細(xì)胞的G0/G1及S期細(xì)胞比例高于0.2、0.1 μg/ml組，G2+M期細(xì)胞比例低于0.2、0.1 μg/ml組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3各組細(xì)胞的Caspase-3、bcl-2及bax表達(dá)水平變化 與對(duì)照組相比，照射組細(xì)胞的Caspase-3及bax表達(dá)水平顯著升高，bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。不同濃度IL-8處理后，細(xì)胞的Caspase-3及bax表達(dá)水平低于照射組，bcl-2表達(dá)水平高于照射組(P<0.05)。0.5 μg/mlg IL-8組bcl-2水平明顯高于0.2、0.1 μg/ml組，0.5 μg/ml IL-8組Caspase-3及bax水平低于0.2、0.1 μg/ml組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

表2 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期比較

與照射組比較：1)P<0.05

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；與照射組相比：2)P<0.05；與IL-8 0.5 μg/ml組比較：3)P<0.05圖1 各組細(xì)胞的caspase-3、bcl-2及bax表達(dá)水平變化

3 討 論

付寶紅等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，血清IL-8與老年非小細(xì)胞肺癌患者放療效果具有明顯的相關(guān)性。本研究提示放療能夠抑制A549細(xì)胞的DNA合成作用，阻止細(xì)胞周期從G1期到S期的轉(zhuǎn)化過(guò)程〔7〕。bcl-2定位于線粒體外膜，能夠通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用；bax蛋白多以非活性的單體形式分布于胞質(zhì)中,只有在接收到凋亡信號(hào)刺激被激活后發(fā)生分子構(gòu)象改變,移位并插入線粒體外膜后形成bax大孔道,破壞線粒體膜的完整性,并與bcl-2等抑制凋亡的蛋白對(duì)抗,阻止其抗凋亡作用。Caspase-3作為Caspase級(jí)聯(lián)下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者,其激活在很大程度上依賴(lài)cyt-c的釋放,而bcl-2家族中的bcl-2、bax基因可通過(guò)線粒體途徑介導(dǎo)cyt-c等物質(zhì)的釋放。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2、bax可作為Caspase-3的上游調(diào)控機(jī)制,參與對(duì)Caspase-3激活和與之相關(guān)的細(xì)胞凋亡途徑的調(diào)節(jié)〔8～10〕。本研究結(jié)果說(shuō)明放射治療能夠明顯抑制A549細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。

A549細(xì)胞為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系。臨床上，部分非小細(xì)胞肺癌患者放療效果不佳。腫瘤放療的敏感性與多種因素相關(guān)，本次研究中細(xì)胞均在對(duì)數(shù)期接受處理，增殖活躍的細(xì)胞對(duì)射線敏感性?xún)?yōu)于增殖較慢的細(xì)胞；且離體培養(yǎng)細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，與射線接觸較為充分，故非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系放療的敏感性較好〔11,12〕。

不同濃度的IL-8呈時(shí)間-劑量依賴(lài)效應(yīng)降低射線對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用。上述研究說(shuō)明IL-8能夠降低人肺癌A549細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。IL-8作為常見(jiàn)的細(xì)胞趨化因子，不僅能促進(jìn)中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，在腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用〔13〕。既往研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血清中的IL-8水平顯著高于正常人群，患者IL-8水平與腫瘤血管密度、病理分型及臨床分期具有重要相關(guān)性，IL-8與腫瘤細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，激活下游信號(hào)分子，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及血管新生的作用。但I(xiàn)L-8影響腫瘤細(xì)胞放療敏感性的具體機(jī)制有待于更加深入的研究〔14,15〕。

綜上所述，IL-8能夠降低A549細(xì)胞的放療敏感性，且呈劑量依賴(lài)效應(yīng)。

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R734.2

A

1005-9202(2017)24-6011-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.003

1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院呼吸內(nèi)科

阮肇?fù)P(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

〔2017-07-13修回〕

(編輯 李相軍)