重組大豆7S球蛋白α′-亞基的分離純化

余少璟 ，許妍妍 ，袁艷秋，周星杰，吉夢(mèng)瑩，欒廣忠(.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 700；. 開封市食品藥品檢測(cè)中心，河南開封 475000)

重組大豆7S球蛋白α′-亞基的分離純化

余少璟1，許妍妍2，袁艷秋1，周星杰1，吉夢(mèng)瑩1，欒廣忠1
(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100；2. 開封市食品藥品檢測(cè)中心，河南開封 475000)

為分離及純化重組大豆7S球蛋白(β-conglycinin)α′-亞基，將大腸桿菌工程菌pET-28a-α′-BL21經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到含有重組7S球蛋白α′-亞基目的蛋白的菌液，再經(jīng)超聲破碎、離心得到粗提的重組蛋白。采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)利用Ni2+親和層析柱進(jìn)一步純化重組蛋白，當(dāng)采用流速為5 mL/min 的平衡液平衡Ni2+柱可以得到較高純度的目的蛋白，純度可達(dá)89.1%。

7S球蛋白；α′-亞基；重組蛋白；分離；純化

7S球蛋白是大豆蛋白的主要組分之一[1]，由α′-亞基(71 ku)、α-亞基(67 ku)、β-亞基(50 ku)3種亞基通過(guò)疏水作用和氫鍵構(gòu)成三聚體[2, 3]。天然的α′-亞基含有2個(gè)N-連接的糖基[4]，在結(jié)構(gòu)上可分為延伸區(qū)(extension region)和核心區(qū)(core region)。欒廣忠等[5]發(fā)現(xiàn)7S球蛋白中的糖基可阻礙由Alcalase酶誘導(dǎo)的凝膠的形成。Maruyama等[6]利用大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出了α和α′核心區(qū)域，并且自組裝出來(lái)了非糖基化的7S球蛋白。由于原核表達(dá)系統(tǒng)與真核表達(dá)系統(tǒng)不同，同樣的基因在不同的表達(dá)系統(tǒng)中得到的目的蛋白的結(jié)構(gòu)也不同。7S球蛋白亞基在原核表達(dá)系統(tǒng)中所表現(xiàn)的不同就在于所得的目的蛋白缺失了N-端的糖基結(jié)構(gòu)，目前已經(jīng)成功重組得到的大腸桿菌工程菌pET-28a-α′-BL21經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)可以得到N-連接糖基缺失的α′-亞基[3]。因此，可以分離純化出重組的α′-亞基，為后續(xù)與天然7S球蛋白α′-亞基之間的性質(zhì)比較做準(zhǔn)備。

親和標(biāo)簽融合技術(shù)在重組蛋白純化領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[7]，具有結(jié)合特異性高、洗脫條件溫和、通用性強(qiáng)、純化倍數(shù)高等顯著優(yōu)點(diǎn)[8]。將目的基因與優(yōu)化的親和標(biāo)簽融合表達(dá)，通過(guò)親和層析獲得純度較高的重組融合蛋白已成為重組蛋白純化的一個(gè)通用方法[9]。本研究中的大腸桿菌工程菌pET-28a-α′-BL21僅N-端帶有6個(gè)組氨酸(His)標(biāo)簽，表達(dá)的重組α′-亞基可以與鎳離子特異性結(jié)合[10]。將菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)得到粗提的重組蛋白α′-亞基后，利用帶有Ni2+親和層析柱的AKTA蛋白純化系統(tǒng)將其進(jìn)一步純化，通過(guò)調(diào)整平衡液的流速來(lái)對(duì)純化條件進(jìn)行篩選。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

陽(yáng)性工程菌株pET-28a-α′-BL21，由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院植物蛋白工程實(shí)驗(yàn)室提供。以‘魯96150’大豆為原料提取總RNA，經(jīng)RT-PCR法擴(kuò)增得到目的基因α′-亞基后與克隆載體pGEM-T Easy相連構(gòu)建重組克隆載體pGEM-α′，pGEM-α′與表達(dá)載體pET28a連接構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pET-28a-α′，經(jīng)鑒定后將重組表達(dá)載體pET-28a-α′轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中，得到陽(yáng)性工程菌pET-28a-α′-BL21[3]。

1.2 試劑與儀器

試劑：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker(3595A)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，大連TaKaRa公司；蛋白胨、酵母粉，賽默飛世爾科技公司；β-巰基乙醇、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED(四甲基乙二胺)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、考馬斯亮藍(lán)R250、考馬斯亮藍(lán)G250、5×蛋白上樣緩沖液、咪唑、苯甲基磺酰氟(PMSF)，北京索萊寶有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、疊氮化鈉、異丙醇、乙醇、磷酸、鹽酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。此外，文中試劑所涉及百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，若有條件變化，會(huì)有特殊說(shuō)明。

儀器：DYY-6C電泳儀，北京六一生物科技有限公司；DYCP-24DN垂直電泳槽，北京六一生物科技有限公司；BIO-RAD680酶標(biāo)儀，美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司；BIO-RAD GelDocXR+凝膠成像儀，美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；雷磁PHS-3C pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2G雙人單面超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DK-98-I電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；BCD-189V冰箱，河南新飛電器集團(tuán)有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；WK2102家用電磁爐，美的電器股份有限公司；CAV1000通風(fēng)櫥，F(xiàn)&S Scientific有限公司；Neofuge 15R冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；TS-100脫色搖床，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；His Trap HP鎳離子親和層析柱，通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GE healthcare)；AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)，通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GE healthcare)；VC130超聲波細(xì)胞破碎儀，美國(guó)Sonics & Materials股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 天然7S球蛋白的分離 參照Nagano等[11]方法，將50 g脫脂大豆粉以1∶15的比例溶于750 mL蒸餾水中，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，室溫下攪拌2 h，懸浮液用濾布(140目)過(guò)濾，濾液于9 500 g條件下離心25 min，得上清液，在其中加入亞硫酸氫鈉至0.98 g/L，用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至6.4，混合物于4 ℃過(guò)夜。混合物在9 500 g離心30 min，得到的沉淀物為大豆球蛋白(11S)。在上清液中加入固體NaCl至濃度為0.25 mol/L，用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，攪拌1 h后，9 500 g離心30 min，得到的上清液用冰水稀釋兩倍體積后用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.8，9 500 g離心20min，得到的沉淀即為粗提的7S球蛋白物。將其用蒸餾水洗滌后調(diào)節(jié)pH至7.0，4 ℃下透析脫鹽后凍干，-20 ℃保存，利用SDS-PAGE電泳進(jìn)行定性分析。

1.3.2 SDS-PAGE SDS-PAGE中所采用的濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%[12]。

制膠所需試劑：30%丙烯酰胺單體貯備液；濃縮膠緩沖液，1.0 mol/L Tris-HCl,pH 6.80；分離膠緩沖液，1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.80；10%SDS；10%APS；TEMED。

樣品與Marker上樣量均為15 μL，樣品上樣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 g/L。

電泳所需試劑：電泳緩沖液(0.125 mol/L Tris，1.25 mol/L甘氨酸，0.5% SDS)；染色液(0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250，φ=10%冰乙酸，φ=30%甲醇)，過(guò)濾后使用；脫色液(φ=10%冰乙酸，φ=30%甲醇)。

1.3.3 重組α′-亞基的提取 參考許妍妍等[3]的方法，并稍有調(diào)整：將大腸桿菌工程菌pET-28a-α′-BL21在振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為37 ℃，120 r/min)至菌液OD600值達(dá)到1.0后，加入誘導(dǎo)劑IPTG(0.2 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)14 h，隨后菌液經(jīng)8 500 r/min、20 min離心后，棄去上清，所得到的沉淀即為菌體細(xì)胞。隨后加入平衡液(PBS：0.5 mol/L氯化鈉，20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，0.02%疊氮化鈉，0.1 mmol/L PMSF，pH 7.4)重懸菌體之后利用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲破碎后(超聲條件為：超聲10 s，間隔2 s，每次5 min，循環(huán)8次，共40 min，4 ℃)，后得到粗提的α′-亞基蛋白液，將其離心，所收集到的上清液可以采用截留分子質(zhì)量為10 ku的Millipore Amicon Ultra-15超濾離心管進(jìn)行一定程度的濃縮[13]，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＠肧DS-PAGE對(duì)其進(jìn)行定性分析。

1.3.4 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 參考程君生等[14]的方法，略有調(diào)整：用牛血清白蛋白(BSA)配置終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 g/L的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0、8、16、24、32、40 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液于96孔板中，并加入超純水定容至每孔體積為40 μL，隨后向其中加入200 μL考馬斯亮藍(lán)染液(0.1%考馬斯亮藍(lán)G-250)，室溫靜置3～5 min(不得出現(xiàn)氣泡)。用酶標(biāo)儀于595 nm處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)反應(yīng)溶液的吸光值，根據(jù)所測(cè)定的結(jié)果繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以此標(biāo)準(zhǔn)曲線為對(duì)照，來(lái)確定樣品中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5 重組α′-亞基的純化條件的篩選 重組α′-亞基的純化用AKTA蛋白純化系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。取1 mL的樣品溶液(上樣前用孔徑為0.45 μm的水溶性濾膜過(guò)濾)注入到已用PBS平衡好的His Trap HP預(yù)裝柱上。先用10倍柱體積的PBS對(duì)柱子進(jìn)行沖洗，利用PBS中含有的氯化鈉將未與Ni2+親和層析柱特異性結(jié)合的雜蛋白洗脫下來(lái)，于280 nm下檢測(cè)并分部收集蛋白峰，直至達(dá)到基線。隨后用含500 mmol/L咪唑[15]的PBS對(duì)樣品進(jìn)行0%～100%的線性洗脫[16]，并收集相應(yīng)蛋白峰。

期間通過(guò)調(diào)整平衡液的流速來(lái)對(duì)重組α′-亞基的純化條件進(jìn)行篩選，將不同條件下收集得到的蛋白峰經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法確定質(zhì)量分?jǐn)?shù)后，通過(guò)SDS-PAGE電泳、Quantity One軟件進(jìn)行分析鑒定[10]。

1.3.6 重組α′-亞基的脫鹽 根據(jù)所收集蛋白峰的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果，將重組蛋白含量較為單一的洗脫液收集起來(lái)，采用超濾離心管進(jìn)行超濾濃縮(4 ℃下3 500 g離心30 min)。利用PBS以及超純水來(lái)對(duì)目的蛋白進(jìn)行脫鹽(重復(fù)離心6～8次)，最后留在濾膜內(nèi)的液體即為純化后的重組蛋白，將其收集并于-20 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 天然7S球蛋白的分離

利用等電點(diǎn)沉淀法得到的天然7S球蛋白電泳得到的SDS-PAGE電泳圖如圖1。

1.天然7S球蛋白 Natural 7S globulin；M.Marker

天然7S球蛋白3種亞基的分子質(zhì)量分別為：α′-(76 ku)，α-(72 ku)和β-(52～54 ku)，通過(guò)與Marker進(jìn)行對(duì)比，Lane 1泳道中97.2 ku與66.4 ku 之間產(chǎn)生的2個(gè)條帶分別是α′和α亞基；而66.4 ku與44.3 ku之間產(chǎn)生的條帶是β亞基。將提取得到的天然7S球蛋白凍干，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 重組α′-亞基的提取

大腸桿菌工程菌pET-28a-α′-BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)超聲破碎、離心得到的上清液中含有粗提的重組蛋白α′-亞基。利用SDS-PAGE電泳對(duì)其進(jìn)行定性分析，如圖2所示。

M.Marker； 1.天然7S Natural 7S； 2.大腸桿菌工程菌pET-28a-α′-BL21經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，超聲破碎、離心所得的上清液 Supernatant ofEscherichiacoliengineering bacteria pET-28a-α′-BL21 after induction culture, ultrasonic crushing and centrifugation

圖2重組α′-亞基的提取
Fig.2SDS-PAGEanalysisofrecombinantα′-subunit

Lane 2泳道中有一個(gè)條帶介于97.2 ku與66.4 ku(即α′和α亞基之間)，為重組的α′-亞基，因其缺少N-連接的糖基，在分子質(zhì)量上與天然的α′亞基有一定差異。因?yàn)榇蟛糠值碾s蛋白以及少部分的目的蛋白存在于沉淀中，因此上清液中雜蛋白較少，電泳條帶不多，而目的蛋白的量也有所降低。采用Quantity One軟件對(duì)條帶進(jìn)行光密度分析，純度為37.2%。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

利用牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

由圖3可以看出，所得蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.994 7，因此，可以用來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析。

2.4 重組α′-亞基純化條件的篩選結(jié)果

在重組α′-亞基的純化過(guò)程中，通過(guò)調(diào)整平衡液流速來(lái)篩選影響α′-亞基純化的條件。本試驗(yàn)設(shè)置平衡液流速分別為5 mL/min、1 mL/min、0.5 mL/min，洗脫液流速為1 mL/min，洗脫體積為100 mL。

得到的洗脫結(jié)果分別如圖4、圖5、圖6所示。

由圖4～6可以看出，隨著平衡液流速的減緩，平衡液洗脫下來(lái)的蛋白峰漸緩，與此同時(shí)洗脫液洗脫下來(lái)的蛋白峰越來(lái)越小，說(shuō)明其中含有目的蛋白的量越來(lái)越少。洗脫液出峰時(shí)間是當(dāng)洗脫液體積分?jǐn)?shù)達(dá)到25%左右時(shí)開始，持續(xù)時(shí)間為1～2 個(gè)柱體積。將收集的蛋白峰通過(guò)超濾離心管濃縮后進(jìn)行脫鹽，隨后得到的SDS-PAGE電泳圖如圖7所示。

圖3 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Bovine serum protein standard curve

由電泳圖可以看出，當(dāng)平衡液流速為5 mL/min時(shí)，洗脫液線性梯度洗脫下來(lái)的蛋白峰在SDS-PAGE電泳圖中，顯示出了單一條帶，通過(guò)與Marker進(jìn)行對(duì)比，得知單一條帶為的重組α′-亞基。而當(dāng)平衡液流速為1 mL/min以及0.5 mL/min時(shí)的電泳條帶均有雜蛋白出現(xiàn)。

采用Quantity one軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)平衡液流速為5 mL/min、1 mL/min、0.5 mL/min時(shí)，洗脫液所得的蛋白峰中，目的蛋白的純度分別為89.1%、20.4%、10.9%。Lane 4(平衡液流速為5 mL/min)的峰值結(jié)果如圖8所示。

由峰值結(jié)果可以看出，Lane 4中目的蛋白的峰值最高，說(shuō)明其中目的蛋白的量最大。此外的一些雜峰一部分是雜蛋白造成的，另一部分則是由于電泳條帶背景值過(guò)高造成的。

綜合以上結(jié)果可知，當(dāng)平衡液流速為5 mL/min時(shí)，采用線性洗脫所得目的蛋白的純度明顯最高。平衡液流速的增加會(huì)減少目的蛋白在平衡過(guò)程中的損失，從而增加了目的蛋白在洗脫蛋白峰中的比例，使其純度升高。而從純化過(guò)程中所得的蛋白峰來(lái)看，仍有一部分的目的蛋白存在于平衡液平衡柱子時(shí)所得的蛋白峰中。分析原因可能是重組蛋白在大腸桿菌中的高表達(dá)會(huì)形成不可溶、無(wú)生物活性的包涵體[17]，而包涵體的形成是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)最大的問(wèn)題[18]，一部分的目的蛋白形成包涵體，無(wú)法與親和標(biāo)簽有效結(jié)合[19]，從而導(dǎo)致其在平衡過(guò)程中被洗脫下來(lái)，使目的蛋白有一定程度的損失。與此同時(shí)，本研究中的目的蛋白的表達(dá)形式屬于細(xì)胞內(nèi)的可溶性表達(dá)，在目的蛋白的提取過(guò)程中，由于細(xì)胞破碎，導(dǎo)致宿主蛋白、內(nèi)毒素等[20]同時(shí)被提取出來(lái)，因此，待純化的樣品中除了目的蛋白，還存在一定的雜蛋白[21]，會(huì)在后期純化過(guò)程中影響純化效果。

圖4 平衡液流速為5 mL/min的蛋白洗脫峰Fig.4 The elution peak of PBS flow rate of 5 mL/min

圖5 平衡液流速為1 mL/min的蛋白洗脫峰Fig.5 The elution peak of PBS flow rate of 1 mL/min

圖6 平衡液流速為0.5 mL/min的蛋白洗脫峰Fig.6 The elution peak of PBS flow rate of 0.5 mL/min

M．Marker； 1、5.陽(yáng)性工程菌株pET-28a-α′-BL21的空白對(duì)照Blank control of the positive engineering strain pET-28a-α′-BL21；2、6.純化后(平衡液流速為0.5 mL/min)樣品與待純化樣品Samples(purified liquid flow rate of 0.5 mL/min) and samples to be purified； 3、7.純化后(平衡液流速為1 mL/min)樣品與待純化樣品Sample(sample flow rate 1 mL/min) and the sample to be purified；4、8.純化后(平衡液流速為5 mL/min)樣品與待純化樣品Sample(sample flow rate 5 mL/min) and the sample to be purified

圖7重組α′-亞基純化電泳圖
Fig.7Electrophoresisofrecombinantα′-subunitpurificationresults

3 結(jié) 論

本研究利用陽(yáng)性工程菌pET-28a-α′-BL21經(jīng)誘導(dǎo)后得到目的蛋白α′-亞基，采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)利用Ni2+親和層析柱通過(guò)調(diào)整平衡液流速，再用洗脫液梯度洗脫的方法將純化條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖8 Lane 4的峰值背景結(jié)果Fig.8 Peak results of Lane 4

結(jié)果表明：當(dāng)用平衡液平衡Ni2+親和層析柱的過(guò)程中，不同的平衡液流速對(duì)洗脫峰中目的蛋白的含量以及質(zhì)量有顯著影響，當(dāng)平衡液流速為5 mL/min時(shí)，可以減少平衡過(guò)程中目的蛋白的損失，提高目的蛋白的純化效果，最終目的蛋白的得率為26.7%，純度為89.1%，含量達(dá)到毫克級(jí)別，可用于之后的性質(zhì)分析。因此，可以采用流速為5 mL/min 的平衡液平衡Ni2+柱，之后再用線性梯度洗脫的方法來(lái)得到較高純度的目的蛋白。

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IsolationandPurificationofRecombinantα′-Subunitof7SGlobulin

YU Shaojing1,XU Yanyan2, YUAN Yanqiu1, ZHOU Xingjie1, JI Mengying1and LUAN Guangzhong1
(1.College of Food Science & Engineering, Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China;2.Kaifeng Food and Drug Detection Center,Kaifeng Henan 475000,China)

To isolate and purify the recombinant β-conglycinin α′-subunit, recombinant α′ subunit was well expressed by anE.coliengineering bacteria pET-28a-α′-BL21 with the inducing of isopropyl thiogalactoside(IPTG). After ultrasonic crushing and centrifugation, the recombinant protein was further purified by the Ni2+affinity chromatography column through AKTA protein purification system. The results showed that the purity of target protein reached to 89.1% when the Ni2+column was equilibrated with balance buffer at the flow rate of 5 mL/min.

β-conglycinin; α′-Subunit; Recombinant protein; Isolation; Purification

2017-05-12

2017-09-19

Sino-Japanese Cooperation Projects Value Promotion of Products from Minor Crops in the Undeveloped Areas of China(No.K332021107); Northwest A&F University International Cooperation Fund Project(No.X2015030).

YU Shaojing, female, master student. Research area:soybean processing technology.E-mail: 1150778345@qq.com

LUAN Guangzhong, male, associate professor.Research area:soybeans,grain and oil processing technology.E-mail: qlgz@nwsuaf.edu.cn

成敏ResponsibleeditorCHENGMin)

日期：2017-12-21

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171221.1651.030.html

2017-05-12

2017-09-19

中日合作項(xiàng)目(K332021107)；西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)際合作基金項(xiàng)目(X2015030)。

余少璟，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榇蠖股罴庸ぜ夹g(shù)。E-mail：1150778345@qq.com

欒廣忠，男，副教授，研究方向?yàn)榇蠖辜凹Z油深加工技術(shù)。E-mail：qlgz@nwsuaf.edu.cn

TS201

A

1004-1389(2017)12-1853-07