高脂血癥大鼠陰莖海綿體細(xì)胞中VEGF及H2S含量的變化對勃起功能的影響①

郭玉剛，馬 超，陳大印，馬運(yùn)躍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154003)

高脂血癥大鼠陰莖海綿體細(xì)胞中VEGF及H2S含量的變化對勃起功能的影響①

郭玉剛，馬 超，陳大印，馬運(yùn)躍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：通過對高脂血癥大鼠陰莖海綿體中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)以及硫化氫(H2S)含量變化的研究探討其對勃起功能的作用。方法:雄性Wistar大鼠32只隨機(jī)分為高脂血癥組16只和正常對照組16只。高脂血癥模型通過對高脂血癥組大鼠喂養(yǎng)高脂飲食完成。于模型建立成功第10天和20天分別取各組大鼠中一半進(jìn)行阿撲嗎啡實(shí)驗(yàn)并觀察其勃起功能。解剖出大鼠陰莖組織制備勻漿后分別通過用雙抗體夾心ELISA法(Double antibody sandwich ELISA)和分光光度計(jì)對大鼠陰莖海綿體內(nèi)的VEGF和H2S進(jìn)行量化測定。結(jié)果:模型組大鼠陰莖海綿體內(nèi)第10天的VEGF含量、H2S合酶活性、陰莖勃起次數(shù)與正常對照組均有顯著性差異(P<0.05)；模型組陰莖海綿體內(nèi)第20天VEGF含量、H2S合酶活性、陰莖勃起次數(shù)與正常對照組均有顯著性差異(P<0.05)；高脂血癥組之間陰莖海綿體內(nèi)第20天與第10天VEGF含量、H2S合酶活性及陰莖勃起次數(shù)差異均有顯著性(P<0.05)。結(jié)論：高脂血癥致使大鼠陰莖組織中VEGF的含量和H2S合酶的活性的降低，VEGF、H2S合酶的活性的降低可能是高脂血癥導(dǎo)致勃起功能障礙(ED)另一發(fā)病機(jī)制。

高脂血癥；VEGF；H2S合酶；勃起功能障礙；陰莖海綿體

高脂血癥(hyperlipidemia)是心腦血管疾病的重要的危險(xiǎn)因素之一，中老年人血脂升高極易引發(fā)心血管疾病和全身動脈粥樣硬化。高脂血癥導(dǎo)致勃起功能障礙的發(fā)生可以在國內(nèi)外現(xiàn)有諸多文獻(xiàn)找到，且國外文獻(xiàn)曾指出勃起功能的改變可能是全身動脈粥樣硬化的早期眾多的臨床表現(xiàn)中的改變之一[1]，同時(shí)國內(nèi)外眾多關(guān)于高脂血癥引起勃起功能改變的文獻(xiàn)指出陰莖動脈狹窄、閉塞的改變多發(fā)生于晚期，而陰莖平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及陰莖的外周神經(jīng)的損傷多發(fā)生在早期。內(nèi)源性H2S是繼一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)之后發(fā)現(xiàn)的另一種具有舒張血管、降壓等作用的氣體信號分子，廣泛的被稱叫做第三種氣體信號分子。VEGF是一種高度生物活性的具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、轉(zhuǎn)移等作用參與體內(nèi)諸多生理和病理過程的多功能細(xì)胞因子,但是就目前的已進(jìn)行的關(guān)于VEGF的研究來看，在ED方面的研究甚少,因此本實(shí)驗(yàn)的研究著重問題旨在研究高脂血癥大鼠陰莖組織中VEGF含量的變化以及H2S合酶活性的變化是否是導(dǎo)致陰莖勃起功能障礙眾多機(jī)制中的另一機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物:實(shí)驗(yàn)所用的大鼠均是由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康的同一批孕育生產(chǎn)的平均體重約300g左右的雄性Wistar大鼠。實(shí)驗(yàn)所用的藥品以及試劑盒: 血清總膽固醇TC試劑盒、甘油三酯TG試劑盒、低密度脂蛋白LDL-C試劑盒、食用豬油、膽固醇、食用蛋黃、甲基硫氧嘧啶、膽鹽、阿撲嗎啡、5′2′ 磷酸吡哆醛、醋酸鋅、三氯醋酸、L2半胱氨酸、對苯二胺鹽酸鹽、三氯化鐵、VEGF試劑盒、考馬斯亮蘭法蛋白試劑。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

將大鼠隨機(jī)分為高脂血癥組(A組)16只，正常對照組(B組)16只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，兩組動物分籠飼養(yǎng)，并保持環(huán)境室溫、濕度、光照、溫度的一致性。

1.2.2 動物模型的制備

①A組喂養(yǎng)高脂飼料，定時(shí)飲水，適當(dāng)輔喂水果。高脂飼料的配方為自行配制。高脂飼料的飲食配方具體如下：復(fù)合飼料90%、1%膽固醇、2%食用蛋黃、7%豬油、0.3%甲基硫氧嘧啶、0.7%膽鹽。兩組大鼠經(jīng)過不同的飲食喂養(yǎng)8周后，分別用相應(yīng)的試劑盒測定TC、TG、LDL-C的含量。當(dāng)測得的三項(xiàng)指標(biāo)均大于正常對照組的2倍時(shí)證明建模成功。②.B組動物每天給予正常的復(fù)合飼料喂養(yǎng)，定時(shí)飲水，適當(dāng)輔喂水果。

1.2.3 指標(biāo)檢測和方法

①血液檢查:在模型建立成功后繼續(xù)喂養(yǎng)，并分別在實(shí)驗(yàn)10d,20d時(shí)早上空腹逐段切斷大鼠尾部收集血樣,并用相應(yīng)的試劑盒無菌環(huán)境中嚴(yán)格按照試劑盒的使用說明和步驟進(jìn)行測定TC、TG、LDL-C的含量。②陰莖勃起功能檢測：于建模成功后第10d、20d，保持實(shí)驗(yàn)室的安靜，確保大鼠處于放松的狀態(tài)，以阿撲嗎啡(APO)5mL/kg于大鼠頸部皮下注射，注射后對大鼠觀察約半小時(shí)，記錄期間陰莖勃起次數(shù)和各組勃起率。大鼠的陰莖勃起的評定方法為：海綿體的充血及龜頭即陰莖體末端明顯露出為準(zhǔn)。③VEGF的測定:本實(shí)驗(yàn)依照VEGF試劑盒的具體說明依次對各組大鼠陰莖海綿體周圍血清 VEGF 含量進(jìn)行檢測。④ 陰莖組織中H2S合酶活性的測定：實(shí)驗(yàn)最后用斷脊髓法處死大鼠并解剖出陰莖組織，把陰莖組織放于50mmol/ L、pH 6.8的冷凍磷酸鉀緩沖液的制備勻漿,然后在 50mL的錐形燒瓶進(jìn)行反應(yīng) ,反應(yīng)底物的總體積為2mL，其中含100mmol/L、pH 7.4磷酸鉀緩沖液、10mmol/L的 L2半胱氨酸、2mmol/L的5′2′磷酸吡哆醛和10%組織勻漿。然后把2mL濃度為1%醋酸鋅加入其中。燒瓶中充入氮?dú)猓?0s 之后再加入0.5mL 50%三氯醋酸中止反應(yīng),水浴1min后將其中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含4mL蒸餾水的試管中,加入0.5mL的20mmol/L 對苯二銨鹽酸鹽和0.4mL的30mmol/L 三氯化鐵。室溫孵育半小時(shí),用752型分光光度計(jì)在波長670nm處檢測溶液吸光度。根據(jù) H2S濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液H2S含量 ,組織中H2S合酶活性以單位重量的組織在單位時(shí)間內(nèi)生成 H2S的量(nmol/mg.tissue.min)表示，采用分光光度法測定H2S濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組血脂情況

先后于建模成功后的第10天、第20天，對兩組大鼠通過TC、TG 、LDL-C試劑盒測得的血脂情況見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組和空白對照組組的血脂情況

注：與對照組比較P<0.05；②與高脂血癥組10d比較P<0.05。

由以上數(shù)據(jù)可以看出，A與B組相較，大鼠血中TC、TG、LDC-C的含量明顯增高，且隨時(shí)間的進(jìn)一步延長A組第20天較A組第10天TC、TG、LDC-C的含量亦有明顯的增高(P<0.05)，具有顯著差異性。

2.2 阿撲嗎啡實(shí)驗(yàn)

模型建立成功后，分別在第10天和第20天，對兩組大鼠進(jìn)行阿撲嗎啡實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的第一步是調(diào)配阿撲嗎啡溶液(鹽酸阿撲嗎啡4mg溶解于生理鹽水中)。然后以5mL/kg給大鼠頸部皮下注射，在安靜的環(huán)境中，保持大鼠不受巨大驚嚇，記下30min內(nèi)的勃起次數(shù)，最后計(jì)算每一組大鼠的陰莖勃起率。見表2。

表2 高脂血癥組與空白對照組大鼠陰莖勃起次數(shù)勃起率的情況

注：與對照組比較P<0.05；②與高脂組10d比較P<0.05。

由以上數(shù)據(jù)可以看出，A與B組相比較，A組的大鼠的勃起次數(shù)和勃起率較B組明顯減低(P<0.05)，并且隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長A組第20d較第10d勃起次數(shù)和勃起率亦有明顯的降低(P<0.05)，差異具有顯著性。

2.3 A組和B組大鼠陰莖組織中VEGF含量、H2S活性

解剖出大鼠陰莖組織制備勻漿后分別通過用雙抗體夾心ELISA法(Double antibody sandwich ELISA)和分光光度計(jì)對大鼠陰莖海綿體內(nèi)的VEGF和H2S進(jìn)行量化測定。見表3。

表活性

注：與對照組比較P<0.05；②與高脂血癥組10d比較P<0.05。

由以上數(shù)據(jù)可以看出，A與B組相比較，A組的VEGF量明顯降低，并且隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長A組第20天較A組第10天高脂組大鼠陰莖海綿體組織中VEGF量明顯降低；A組H2S活性較對照組明顯降低，并且第20天大鼠陰莖海綿體組織中H2S活性較10d降低(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且還可以 從表中的數(shù)據(jù)看出二者的改變趨勢呈現(xiàn)相同的改變。

2.4 大鼠陰莖組織中VEGF量與H2S含量的相關(guān)性分析

見表4。

表4 大鼠陰莖組織中VEGF的量與H2S含量的相關(guān)性分析

通過統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析的數(shù)據(jù)得知大鼠陰莖組織中VEGF的平均值與H2S含量呈顯著性正相關(guān)。

3 討論

ED隨日常工作和生活節(jié)湊的加快，生活壓力的增加，有逐年增高的趨勢，嚴(yán)重影響中老年男性患者的生活質(zhì)量和夫妻關(guān)系的和諧度，所以其流行病學(xué)和發(fā)病機(jī)制的研究成為世界上很多學(xué)者研究的著重研究方向。陰莖動脈血流的增加、海綿體竇舒張、陰莖靜脈血回流減少三者間能夠協(xié)調(diào)[2]配合的神經(jīng)體液機(jī)制是陰莖正常勃起不可或缺的必備條件，這是通過既往的大量實(shí)驗(yàn)研究所得出的結(jié)論。NO/cGMP是正常發(fā)動陰莖勃起功的經(jīng)典通路。H2S通過調(diào)節(jié)平滑肌的張力而對血管的生理性產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用,而它的舒張血管的作用是通過促使內(nèi)皮源性超極化因子及NO從內(nèi)皮細(xì)胞中釋放來實(shí)現(xiàn)的。半胱氨酸經(jīng)過胱硫醚-β-合成酶(CBS) 和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE) 催化而生成下內(nèi)源性H2S[3]。研究發(fā)現(xiàn)人類陰莖海綿體組織內(nèi)也表達(dá)CBS和CSE[4]，國外也有向靈長類動物的海綿體內(nèi)注射硫氰化鈉(NaHS，內(nèi)源性H2S在體內(nèi)的一種存在形式)，可使陰莖長度和海綿體壓力有明顯的增加[5]的實(shí)驗(yàn)，所以H2S與勃起功能的關(guān)系是不言而喻的，因此高脂血癥導(dǎo)致陰莖勃起功能障礙與H2S合酶活性下降應(yīng)該存在關(guān)聯(lián)。此外H2S 的舒張調(diào)節(jié)功能不完全依賴cAMP的調(diào)節(jié)機(jī)制，還存在其它生理機(jī)制[6]。如K+-ATP 通道，既往的研究發(fā)現(xiàn)H2S在機(jī)體其它組織內(nèi)還可以通過Cl-/HCO3-通道發(fā)揮舒張調(diào)節(jié)功能，但該通路尚未在陰莖海綿體平滑肌組織中有相關(guān)研究[7]。H2S與NO在陰莖勃起過程中可以相互影響。 H2S可以通過直接影響內(nèi)皮源性NO合酶(eNOS) 在組織內(nèi)的表達(dá)，也可以通過開放 K+-ATP 通道或結(jié)合四氫生物喋呤 (NOS的輔助因子)影響eNOS的活性，從而影響NO的產(chǎn)生。H2S也可能通過減少組織對 L-精氨酸(eNOS產(chǎn)生NO的底物) 在組織器官的攝取而影響NO的合成[8]。NO可以通過對活性底物L(fēng)-半胱氨酸的調(diào)節(jié)[9]，因此H2S對大鼠勃起功能的影響的機(jī)制是比較復(fù)雜的，可能以其中的一種機(jī)制為主導(dǎo)，也可以是幾條機(jī)制并存并相互影響的結(jié)果。

VEGF具有高度的生物活性，在機(jī)體內(nèi)參與了體內(nèi)諸多生理和病理過程發(fā)揮眾多作用，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖、轉(zhuǎn)移[10]等多種功能，它最早是作為一種特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增值、生長的因子由 Ferrara 等[11]從牛的垂體星形濾泡細(xì)胞分離提取出的。上世紀(jì)九十年代末Burehardt等曾發(fā)現(xiàn)許多不同的VEGF-mRNA的剪接變體可以在大鼠和人陰莖中表達(dá),其中以VEGF164(大鼠的)或VEGF165(人的)編碼的蛋白的量居多。國內(nèi)外都有相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)染VEGF基因?qū)用}性ED大鼠治療有效。由此看出,VEGF與陰莖勃起關(guān)系密切。

本研究通過對高脂血癥大鼠陰莖海綿體中VEGF、 H2S的含量變化的測量,證明了它們與ED之間關(guān)聯(lián)性,即當(dāng)高脂血癥發(fā)生時(shí)，VEGF的量與H2S的量都發(fā)生了相應(yīng)不同程度的降低，通過相關(guān)性分析，可以證實(shí)二者存在關(guān)聯(lián)并呈正相關(guān)性改變,這豐富了高脂血癥引起勃起功能障礙的發(fā)病機(jī)制,同時(shí)也為ED的治療提供了一定的理論依據(jù)。但是該研究未證實(shí)VEGF是直接影響H2S含量的變化還是通過影響NO的產(chǎn)生繼而在影響H2S量的改變，以及是否二者之間存在明確的作用通路導(dǎo)致高脂血癥時(shí)勃起功能障礙的發(fā)生，總之該研究領(lǐng)域還很局限,大量的問題亟待探究,需要我們進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

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黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題，編號：2012-220。

郭玉剛(1967～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。

R589.2

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1008-0104(2017)06-0047-03

2017-06-12)