連翹酯苷A對(duì)內(nèi)毒素致雞血白介素-17和白介素-6水平的影響①

程廣東，張 強(qiáng)，岳麗紅，關(guān)楠楠，周清波，付釣鈞，王 萌，李艷華

(1．佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007；2．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030；3.佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

連翹酯苷A對(duì)內(nèi)毒素致雞血白介素-17和白介素-6水平的影響①

程廣東1,2，張 強(qiáng)3，岳麗紅1，關(guān)楠楠1，周清波1，付釣鈞1，王 萌3，李艷華2

(1．佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007；2．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030；3.佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：研究連翹酯苷A和內(nèi)毒素作用雞后，雞脾器官指數(shù)、雞血IL-17 和IL-6 mRNA表達(dá)量與蛋白含量與炎癥反應(yīng)關(guān)系。方法：選取80只1d齡健康A(chǔ)A肉雞隨機(jī)分為4組，分別為control組，LPS組，30組(30 mg·kg-1連翹酯苷低劑量組)和60組(60 mg·kg-1連翹酯苷高劑量組)，各組雞收集雞脾臟、血和血清，計(jì)算雞脾臟器官指數(shù)、通過采用qRT-PCR和ELISA方法檢測(cè)血液和血清中IL-17 和IL-6水平。結(jié)果：與正常組相比，LPS組脾器官指數(shù)上升，血液中IL-17 和IL-6 mRNA 表達(dá)量升高；與LPS組比較，連翹酯苷A劑量組脾器官指數(shù)下降，血液中IL-17和IL-6 mRNA表達(dá)量下降；與正常組相比，LPS組血清中IL-17 和IL-6蛋白含量升高；與LPS組比較，連翹酯苷A組血清中IL-17 和IL-6蛋白含量下降。結(jié)論：試驗(yàn)表明連翹酯苷A可以通過基因和蛋白水平抑制LPS誘導(dǎo)的雞血中IL-17 和IL-6 mRNA表達(dá)量和蛋白含量的升高，起到免疫調(diào)節(jié)作用，達(dá)到抗炎效應(yīng)。

連翹酯苷A；脂多糖；雞；白介素-17；白介素-6

內(nèi)毒素又稱脂多糖，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組分之一，常被用于構(gòu)建炎癥模型，引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)[1]。而連翹酯苷A單體是連翹的主要成分之一，具有連翹的鎮(zhèn)痛、解熱、抗氧化、抗病毒及抗菌等活性，可通過介導(dǎo)一些炎癥通路和免疫因子，調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)。脾臟和血液是發(fā)生免疫應(yīng)答的主要場(chǎng)所，當(dāng)機(jī)體發(fā)生病變，免疫因子含量往往發(fā)生變化，血液是許多免疫事件發(fā)生的主要場(chǎng)所，也是各種免疫細(xì)胞重要載體，在機(jī)體的免疫活動(dòng)中起著重要作用。為此，血液和脾臟免疫指標(biāo)常被作為判斷疾病的依據(jù)。IL-17和IL-6是免疫反應(yīng)中重要的促炎因子，張偉潔等[2]報(bào)道IL-6是自身免疫性疾病和慢性炎癥中主要炎癥因子，其含量變化對(duì)診斷疾病起著重要作用。IL-17由IL-17A～F等6個(gè)家族成員組成，是一種促炎因子[3，4]。IL-17與IL-17受體反應(yīng)后引起生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體IL-6等炎癥因子產(chǎn)成，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，在機(jī)體的免疫性疾病和腫瘤中等也起到重要作用[5，6]。故本研究采用LPS構(gòu)建雞炎癥模型，在連翹酯苷A作用下，檢測(cè)雞血液中IL-17和IL-6等炎癥因子含量，研究藥物作用的時(shí)間和劑量效應(yīng)，分析IL-17和IL-6 蛋白和mRNA之間的關(guān)系，從IL-17和IL-6轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，探討連翹酯苷A抗LPS誘導(dǎo)的雞血液炎癥中的機(jī)制，為連翹酯苷A作為中藥添加劑在雞免疫調(diào)控中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要儀器

1日齡AA肉雞均購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物中心。主要試劑盒：ELISA等試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。LPS和連翹酯苷 A(純度>98%)購(gòu)于黑龍江四葉草生物科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光染料購(gòu)于上海羅氏公司。主要儀器：LightCycler480(美國(guó)Roche公司)，酶標(biāo)儀型號(hào)(瑞士TECAN-F50) 。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理

80只1日齡雛雞被隨機(jī)分為4組，每組20只，分別為：control組，LPS組，30 mg·kg-1連翹酯苷低劑量組(30組)和60 mg·kg-1連翹酯苷高劑量組(60組)。正常飼養(yǎng)14d，當(dāng)雞生長(zhǎng)到15d齡時(shí)，開始對(duì)各組雞分別進(jìn)行處理。以30 mg·kg-1和60 mg·kg-1連翹酯苷A劑量對(duì)連翹酯苷低劑量組和連翹酯苷高劑量組雞進(jìn)行灌胃，以相同劑量生理鹽水給其余兩組雞灌服；生長(zhǎng)至21d齡時(shí)，除control組雞外，其余組雞均以200μg·kg-1劑量LPS翅內(nèi)靜脈注射，3h后，稱重所有雞，心臟采血并處死，將雞心臟血收集分為三部分，一部分分裝到1.5mL EP管中，并立即加入TRIZOL，用來提取血液中RNA；一部分收集到試管中，傾斜放置在4℃冰箱析出血清，用來檢測(cè)蛋白含量；一部分加入5%檸檬酸鈉至于小燒杯中，獲得全血；做好標(biāo)記，并無菌剖檢分離雞脾臟，電子天平稱重，并計(jì)算雞脾器官指數(shù)。

1.2.2 ELISA檢測(cè)血清中IL-17和IL-6蛋白含量

將試管中析出血清收集并分裝到1.5mL EP管中，做好標(biāo)記，按程廣東[7]論文中操作說明檢測(cè)各組血清樣品IL-17和IL-6含量。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)全血中IL-17和IL-6 mRNA表達(dá)量

將0.9mL TRIZOL試劑直接加到裝有0.5mL全血的1.5mL EP管中，快速提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板，檢測(cè)雞血液中IL-17和IL-6的CP值，β-actin作為內(nèi)參校正，利用歸一法比較各組雞血液中IL-17和IL-6的mRNA表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 連翹酯苷A抑制LPS致炎雞臨床癥狀

見表1。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常組雞相比，LPS組雞精神狀態(tài)低迷、不愿走動(dòng)、肛門及尾部區(qū)域有糞便污染、觸摸雞體溫升高、飲食量下降、飲水量上升；而連翹酯苷A劑量組雞癥狀僅出現(xiàn)輕微的食欲下降，其余癥狀與正常組相同。

2.2 連翹酯苷A抑制LPS致炎雞脾器官指數(shù)的影響

見表1。

表1 連翹酯苷A抑制LPS致炎雞脾器官指數(shù)

由表1可見，與正常組雞脾器官指數(shù)比較，LPS組雞脾器官指數(shù)極顯著上升(P<0.01)，連翹酯苷A低劑量組顯著上升(P<0.05)，高劑量組差異極顯著上升(P<0.01)；與LPS組雞脾器官指數(shù)比較，連翹酯苷 A低劑量組雞脾器官指數(shù)顯著下降(P<0.05)，與高劑量組雞脾器官指數(shù)差異不顯著。

2.3 血清中IL-17和IL-6蛋白含量

見圖1。

圖1 連翹酯苷A對(duì)LPS致炎雞血清中IL-17和IL-6蛋白含量的影響

由圖1可見，與正常組雞血清比較，LPS組雞血清中IL-17蛋白含量極顯著增加(P<0.01)；連翹酯苷A組雞血清中IL-17蛋白含量升高，30mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A可極顯著增加雞血清中IL-17蛋白含量(P<0.01)。與LPS組相比，30mg·kg-1和60mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A均可抑制LPS誘導(dǎo)的雞血清中IL-17蛋白含量，并與60mg·kg-1濃度的連翹酯苷A組差異極顯著(P<0.01)，表明連翹酯苷A在抑制LPS誘導(dǎo)炎癥方面具有一定的劑量效應(yīng)。與正常組雞血清比較，LPS組雞血清中IL-6蛋白含量極顯著增加(P<0.01)；30mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A使雞血清中IL-6蛋白含量極顯著增加(P<0.01)，60mg·kg-1濃度的連翹酯苷A組使雞血清中IL-6蛋白含量極顯著下降(P<0.01)。與LPS組雞血清比較，連翹酯苷A組中IL-6蛋白含量下降，并成劑量效應(yīng)關(guān)系，30mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A可顯著抑制雞血清中IL-6蛋白含量(P<0.05)，60mg·kg-1濃度的連翹酯苷A可極顯著抑制雞血清中IL-6蛋白含量(P<0.01)。

2.4 全血中IL-17和IL-6 mRNA的表達(dá)量

見圖2。

圖2 連翹酯苷A對(duì)LPS致炎雞血液中IL-17和IL-6 mRNA表達(dá)量的影響

由圖2可見，雞血液中 IL-17和IL-6的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)結(jié)果，與正常組雞血液相比，LPS組雞血液中 IL-17 mRNA的表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；與LPS組雞血液比較，連翹酯苷 A劑量組IL-17 mRNA的含量極顯著下降(P<0.01)，表明30 mg·kg-1和60mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A均可抑制LPS誘導(dǎo)的IL-17 mRNA的表達(dá)量。與正常組比較，LPS組雞血液中IL-6的mRNA表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；與LPS組雞血液比較，30mg·kg-1和60mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A劑量組可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6 mRNA的表達(dá)量(P<0.01)。

3 討論

3.1 連翹酯苷A對(duì)LPS致炎雞臨床癥狀

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS組雞低頭、狀態(tài)低迷、肛門及尾部區(qū)域有糞便污染、接觸雞體溫升高、飲欲增強(qiáng)、飲食減少，而連翹酯苷A劑量組雞飲食欲基本正常，這表明LPS能引起雞炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為體溫升高、飲水量上升等；而一定濃度的連翹酯苷A可減輕LPS引發(fā)的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為雞體溫下降、飲水量基本恢復(fù)正常等。

3.2 連翹酯苷A對(duì)LPS致炎雞脾器官指數(shù)的影響

多項(xiàng)研究[8,9]報(bào)道一些物質(zhì)可促進(jìn)雛雞的免疫器官發(fā)育，使免疫器官指數(shù)升高。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)表明連翹酯苷A和LPS均影響脾器官指數(shù)，LPS組雞脾器官指數(shù)升高，而器官指數(shù)往往體現(xiàn)了機(jī)體的免疫水平，尤其免疫器官的器官指數(shù)，而脾臟作為外周免疫器官，器官指數(shù)的變化對(duì)機(jī)體狀態(tài)具有較好的提示作用。LPS使脾器官指數(shù)上升原因可能為L(zhǎng)PS刺激脾臟活化，使脾臟的T、B淋巴細(xì)胞含量增多，脾重量迅速上升，使脾器官指數(shù)比正常組雞明顯升高，而與LPS組雞脾器官指數(shù)相比，連翹酯苷A可使脾器官指數(shù)下降，降低了脾臟的免疫水平，但由于一定程度上已活化了脾臟的T、B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致脾器官指數(shù)比正常組雞明顯升高，而脾器官指數(shù)體現(xiàn)機(jī)體的免疫水平，表明30mg·kg-1和60mg·kg-1濃度的連翹酯苷 A可增加機(jī)體的免疫力，進(jìn)而抑制LPS引發(fā)的炎癥反應(yīng)。

3.3 血液IL-17、IL-6表達(dá)量與免疫關(guān)系

梁正敏等[10]研究發(fā)現(xiàn)LPS可引起小鼠血清中IL-17與IL-6蛋白含量升高，而不同濃度復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液可降低小鼠血清中IL-17與IL-6蛋白含量，減輕由LPS引發(fā)的小鼠炎癥反應(yīng)，這表明IL-17和IL-6蛋白在炎癥反應(yīng)中起著重要作用。李璇等[11]研究發(fā)現(xiàn)IL-6在潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清含量升高，而潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)系密切。潘佳秋等[12]研究發(fā)現(xiàn)IL-6在彌漫性毒性甲狀腺腫患者血清中升高，并且其可能與彌漫性毒性甲狀腺腫發(fā)病免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制有關(guān)。蘇曉健等[13]研究發(fā)現(xiàn)LPS可使小鼠子宮內(nèi)膜發(fā)生炎癥，通過識(shí)別天然免疫系統(tǒng)中Toll樣受體4，活化其下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起下游TNF-ɑ等炎癥因子上升。德力拜爾,賽福丁等[14]研究發(fā)現(xiàn)阿魏根粗多糖對(duì)雞脾臟和外周血淋巴細(xì)胞體外增殖起到一定的作用，表明阿魏根粗多糖可通過影響機(jī)體重要免疫器官影響機(jī)體免疫水平。程廣東等[15]研究發(fā)現(xiàn)LPS和連翹酯苷A作用于雞后，雞法氏囊中炎癥因子mRNA表達(dá)量與蛋白含量之間存在相關(guān)性，整體上表現(xiàn)為炎癥因子mRNA表達(dá)量與蛋白含量變化趨勢(shì)一致，且有一定的時(shí)間和劑量效應(yīng)。為此，推測(cè)血液中炎癥因子mRNA表達(dá)量與蛋白含量變化趨勢(shì)一致。此外，吳悅等[16]研究表明連翹酯苷可通過干預(yù)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的雞胸腺組織抗氧化功能介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)，表明連翹酯苷可通過介導(dǎo)抗氧化和炎癥因子指標(biāo)調(diào)控炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS可引起雞血中IL-17和IL-6 mRNA表達(dá)量與蛋白含量增加，而連翹酯苷A可導(dǎo)致LPS組雞IL-17和IL-6 mRNA表達(dá)量與蛋白含量下降，表明連翹酯苷A可能通過影響轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制LPS組雞IL-17和IL-6 mRNA表達(dá)量與蛋白含量，進(jìn)而通過炎癥通路調(diào)控免疫應(yīng)答。

本試驗(yàn)表明，LPS可引起雞血中IL-17和IL-6蛋白和mRNA表達(dá)量增加，而連翹酯苷A可導(dǎo)致LPS組雞血中IL-17和IL-6 蛋白和mRNA的表達(dá)量下降，整體上表現(xiàn)為IL-17和IL-6 mRNA表達(dá)量與蛋白含量變化趨勢(shì)一致，表明連翹酯苷A可通過抑制雞血中IL-17和IL-6 蛋白和mRNA表達(dá)量，抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥效應(yīng)，緩解炎癥反應(yīng)。

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EffectofForsythiasideAonIL-17andIL-6levelinblood
ofchickensinducedbylipopolysaccharide

CHENGGuang-dong1,2,ZHANGQiang3,YUELi-hong1,GUANNan-nan1
ZHOUQing-bo1,FUDiao-jun1,WANGMeng3,LIYan-hua2

(1.College of Life Science, Jiamusi University,Jiamusi 154007, China;2. College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 3.College of Public Health, Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

Objective: To investigate the relationship among spleen organ index, inflammatory reaction, IL-17 and IL-6 protein and mRNA levels in blood of chicken after administrated by Forsythiaside A and Lipopolysaccharide (LPS).Methods80 AA broilers were selected and randomly divided into four groups, control group，LPS group， low Forsythiaside A dosage group and high Forsythiaside A dosage group. Spleen、blood and serum were collected for IL-17 and IL-6 level detection by qRT-PCR and ELISA.ResultsSpleen organ index, IL-17 and IL-6 mRNA blood levels in LPS group were increased compared with control group. Spleen organ index, IL-17 and IL-6 mRNA expression in Forsythiaside A groups were lower than LPS group. IL-17 and IL-6 mRNA expression in chicken blood were enhanced which was induced by LPS. Decreased protein expression of IL-17 and IL-6 in serum were observed in Forsythiaside A groups, as compared with LPS group.ConclusionsForsythiaside A achieved its immunomodulatory and anti-inflammatory effect by inhibiting the increased IL-17 and IL-6 expression induced by LPS in chicken.

Forsythiaside A; lipopolysaccharide; chicken; IL-17; IL-6

1.黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目，編號(hào)：C201450；2.黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目，編號(hào)：201610222062；3.佳木斯大學(xué)校級(jí)青年科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：Sq2013-028。

程廣東(1978～)男，黑龍江大興安嶺呼中人，博士，副教授。

李艷華(1970～)女，黑龍江密山人，博士，教授。 E-mail:liyanhua1970@163.com。

R285.5

A

1008-0104(2017)06-0025-03

2017-06-17)